孫 敏， 劉嘉銘， 張麗萍*， 付大友， 譚文淵

(1.四川理工學(xué)院， 四川 自貢 643000； 2.四川大學(xué) 華西臨床醫(yī)學(xué)院, 四川 成都 610041)

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荷葉中4種黃酮類物質(zhì)含量的測(cè)定

孫 敏1， 劉嘉銘2， 張麗萍1*， 付大友1， 譚文淵1

(1.四川理工學(xué)院， 四川 自貢 643000； 2.四川大學(xué) 華西臨床醫(yī)學(xué)院, 四川 成都 610041)

為快速、簡(jiǎn)便地定性定量荷葉中的黃酮類物質(zhì)，建立高效液相色譜法測(cè)定荷葉中金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素4種黃酮含量的方法。結(jié)果表明：在其分析測(cè)定條件色譜柱為 Gemini C18，柱溫為40℃，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸(55∶45，體積比)，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm的條件下， 金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量分別在1.5～48.0 μg/mL，1.0～32.0 μg/mL，1.0 ～32.0 μg/mL，0.7～24.0 μg/mL線性關(guān)系良好，方法的回收率為90%～103%，精密度為3.5%～4.2%，荷葉中4種黃酮含量依次為1.94%、0.092%、0.025%和0.016%。該方法可用于荷葉樣品4種黃酮類物質(zhì)的含量測(cè)定。

荷葉； 黃酮； 高效液相色譜

荷葉是一種常見(jiàn)的藥食兩用植物，所含化學(xué)活性成分主要有生物堿及黃酮類物質(zhì)[1]。從荷葉中提取的黃酮類物質(zhì)安全無(wú)害，是一種優(yōu)良的黃酮潛在資源。2010版《中國(guó)藥典》制定了荷葉中生物堿及荷葉堿含量測(cè)定方法，但未建立檢測(cè)其黃酮成分的方法。

目前，關(guān)于黃酮成分測(cè)定方法已有報(bào)道[2-6]。其中，分光光度法[2]只能測(cè)定黃酮總量，而集分離和檢測(cè)技術(shù)于一體的高效液相色譜法[3-6]則可在一定程度上對(duì)黃酮進(jìn)行定性定量檢測(cè)。如，2010版藥典[5]采用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)了銀杏葉提取物黃酮中槲皮素、山奈酚和異鼠李素的含量，并以三者之和乘以適當(dāng)系數(shù)作總黃酮含量。

不同植物、不同提取方法所得到的黃酮種類和含量不同，其藥用價(jià)值也有明顯差異。因此，充分了解荷葉提取物中黃酮的種類及含量十分必要。筆者通過(guò)質(zhì)譜法確定了荷葉提取物中黃酮類物質(zhì)主要有槲皮素、金絲桃苷、山奈酚和異鼠李素。由于質(zhì)譜儀價(jià)格較貴，廣泛應(yīng)用受到一定限制，故借鑒文獻(xiàn)[3-6]的研究思路，建立HPLC測(cè)定荷葉中金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量的方法，以期為荷葉中黃酮類物質(zhì)快速、準(zhǔn)確的測(cè)定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

對(duì)照品金絲桃苷(HPLC,批號(hào)JS90090)、槲皮素(HPLC,批號(hào)JS90083)、山奈酚(HPLC,批號(hào)JS90129)、異鼠李素(HPLC,批號(hào)JS90190)均購(gòu)于上海金穗生物科技有限公司，荷葉(產(chǎn)于四川成都)。

Agilent1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，(廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司)，質(zhì)譜儀(安捷倫科技有限公司)，AUW120D電子分析天平(日本島津公司)。

1.2 色譜條件的優(yōu)化

1.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別取一定量的金絲桃苷、山奈酚、槲皮素和異鼠李素對(duì)照品溶液于10 mL的比色管中，用甲醇定容至刻度，在紫外可見(jiàn)分光度計(jì)上掃描，選擇有最大吸收的波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.2 流動(dòng)相體系的選擇 分別對(duì)甲醇-0.1%磷酸和乙腈-0.1%磷酸兩種流動(dòng)相體系的配比進(jìn)行考察，選擇具有良好分離效果的體系為流動(dòng)相。

1.2.3 流速的選擇 試驗(yàn)考察了0.4 mL/min、0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min的分離效果，選擇分離效果好的流速進(jìn)樣測(cè)定。

1.3 色譜條件

色譜柱：Gemini C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為40℃，以色譜條件優(yōu)化的檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相和流速進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為20μL。

1.4 對(duì)照與樣品溶液的制備

1.4.1 對(duì)照 分別稱取金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素30.0 mg、20.0 mg、20.0 mg、15.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度分別為300 μg/mL、200 μg/mL、200 μg/mL、150 μg/mL的混合標(biāo)液，置于冰箱中保存。

1.4.2 樣品 荷葉在50℃下烘干至恒重，粉碎過(guò)60目篩，稱取粉末5.0 g置于索氏提取裝置中，用70%乙醇加熱回流2 h，過(guò)濾棄濾渣，最后用乙醇定容于100 mL容量瓶中備用。

1.5 質(zhì)譜法定性鑒定

將荷葉提取液用石油醚洗滌后，在負(fù)離子電離模式下采用全掃描方式測(cè)定，掃描范圍：200～700 m/z。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

移取1.4中混合標(biāo)液25 μL、50 μL、100 μL、200 μL、400 μL、600 μL、800 μL于5 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，按照1.2的方法操作，進(jìn)樣20 μL分析，以濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，測(cè)繪計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)指標(biāo)。

1.7 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液和樣品溶液各20 μL按照優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

1.8 方法學(xué)考察

1.8.1 系統(tǒng)精密度 移取混合標(biāo)液20 μL，按照1.3測(cè)定相應(yīng)含量，平行5次試驗(yàn)。

1.8.2 樣品穩(wěn)定性 移取樣品溶液20 μL，按照1.3的方法操作，分別在0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各成分含量。

1.8.3 加標(biāo)回收率 稱取5.0 mg荷葉粉末，加入一定量的標(biāo)液，按照1.4.2處理樣品，按照1.3測(cè)定相應(yīng)含量，平行3次試驗(yàn)。

1.9 樣品含量測(cè)定

按照1.4.2處理樣品，按照1.3測(cè)定相應(yīng)含量，平行5次試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜法定性鑒定

由圖1可知，金絲桃苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素的質(zhì)荷比依次為463、301、285、315。質(zhì)譜圖結(jié)果表明，荷葉提取液中含有金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng) 金絲桃苷、山奈酚、槲皮素和異鼠李素在波長(zhǎng)為360 nm時(shí)均有較好吸收，故選擇于波長(zhǎng)360 nm處進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.2 流動(dòng)相體系 首先采用乙腈-0.1%磷酸等度洗脫條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示4種黃酮成分不能進(jìn)行有效分離，故接著采用梯度洗脫程序進(jìn)行一系列的流動(dòng)相條件優(yōu)化后，4種化合物雖然得到分離，但保留時(shí)間達(dá)到22 min左右，分析時(shí)間較長(zhǎng)。最后采用甲醇-0.1%磷酸流動(dòng)相體系進(jìn)行研究，通過(guò)改變其流動(dòng)相配比四種目標(biāo)成分得到有效分離，在甲醇∶0.1%磷酸為55%∶45%時(shí)峰形較好，且保留時(shí)間在14 min左右，明顯縮短了分析時(shí)間。

注：1為山奈酚， 2為槲皮素， 3為異鼠李素， 4為金絲桃苷

Note:1, isorhamnetin; 2, kaempferol; 3, quercetin; 4,hyperoside.

圖1 荷葉提取液樣品質(zhì)譜圖

Fig.1 The mass spectrum of lotus leaves extract

注：1為金絲桃苷， 2為槲皮素， 3為山奈酚，4為異鼠李素

Note:1, hyperoside; 2, quercetin; 3, kaempferol; 4,isorhamnetin.

圖2 混合對(duì)照品(A)和樣品(B)的HPLC色譜圖

Fig.2 Chromatograms of reference substances (A) and samples(B)

2.2.3 流速 當(dāng)流速小于1 mL/min時(shí)，保留時(shí)間較長(zhǎng)；當(dāng)流速大于1.0 mL/min時(shí)，保留時(shí)間雖然明顯減小，但流速過(guò)大柱壓太高會(huì)影響色譜柱的壽命。當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)，峰形較好保留時(shí)間適宜，故選其為該方法的流速。

2.2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性 由圖2的色譜圖計(jì)算得4種黃酮物質(zhì)的理論塔板數(shù)均大于1000 0，色譜圖中1、2、3、4分別代表的金絲桃苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素4種黃酮物質(zhì)峰的分離度均大于1.5，且保留時(shí)間適宜，說(shuō)明系統(tǒng)的適應(yīng)性符合要求，即試驗(yàn)所選擇的色譜操作條件符合定量分析要求。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素濃度分別在1.5～48.0 μg/mL、1.0～32.0 μg/mL、1.0～32.0 μg/mL、0.7～24.0 μg/mL線性關(guān)系良好，回歸方程分別為y=21.388x+1.1625(R=0.999 9)、y=28.065x+7.519 1(R=0.999 9)、y=32.152x+6.994 2(R=0.999 9)、y=19.27 3x+1.421 2(R=0.999 8)。

2.4 樣品含量測(cè)定

荷葉中金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素的含量分別為1.94%、0.092%、0.025%和0.016%。相應(yīng)RSD分別2.4%、3.2%、4.5%和3.9%，表明建立的方法重復(fù)性良好。

2.5 方法學(xué)考察結(jié)果

系統(tǒng)精密度：金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量的RSD分別為1.5%、0.9%、1.0%、1.5%，表明高效液相色譜法的操作系統(tǒng)的精密度良好。

樣品穩(wěn)定性：金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量的RSD依次為1.4%、3.0%、3.4%和2.4%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表 高效液相色譜法測(cè)定荷葉中黃酮類物質(zhì)的加標(biāo)回收率

加標(biāo)回收率：金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素平均回收率依次為98.8%、99.3%、93.3%、93.3%，RSD依次為4.2%、4.1%、3.6%、3.5%(表)，表明測(cè)定方法可行。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立的高效液相色譜法，在色譜柱：Gemini C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm )；流動(dòng)相：A為甲醇(55%)，B為0.1%磷酸水溶液(45%)，流速為1 mL/min，柱溫：40℃，進(jìn)樣量：20 μL條件下可同時(shí)測(cè)定荷葉中金絲桃苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素4種成分，方法的精密度為1.8%～2.5%，回收率為94.3%～101.3%，樣品中金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量依次為1.94%、0.092%、0.025%、0.016%。說(shuō)明該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于荷葉提取物的質(zhì)量控制。

[1] 趙小亮,王智民,馬小軍,等.荷葉化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(5):703.

[2] 鄧勝國(guó),鄧澤元,范亞葦.紫外分光光度法測(cè)定荷葉總黃酮含量[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào):理科版,2008,32(2):148-150.

[3] 黨 軍,張興旺,陶燕鐸.高效液相色譜法測(cè)定野蔥中黃酮類化合物[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2012,2(2):282-286.

[4] 周蘭香,黃阿根.分光光度與HPLC法測(cè)定荷葉總黃酮的研究[J].中草藥,2002,33(1):35.

[5] 趙艷波,施曉光.高效液相色譜法測(cè)定荷葉中總黃酮量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志.2010,30(20):1795.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

(責(zé)任編輯：孫小嵐)

Determination of Four Kinds of Flavonoids in Lotus Leaves

SUN Min1， LIU Jiaming2, ZHANG Liping1*， FU Dayou1， TAN Wenyuan1

(1.SichuanUniversityofScience&Engineering.Zigong643000,Sichuan,China; 2.WestChinaSchoolofMedicine,SichuanUniversity.Chengdu610041,China)

To establish a quick and easy method of qualitative and quantitative analysis for determining the content of hyperoside, quercetin, kaempferol and isorhamnetin in lotus leaves by HPLC.Results: Under conditions of Gemini C18 for the chromatographic column and 40℃ for column temperature, with methanol-0.1% phosphoric aicd(55∶45，v∶v)of the mobile phase and 1 mL/min of flow velocity, 360nm for the detection wavelength, the linear ranges of hyperoside, quercetin, kaempferol and isorhamnetin were 1.5～48.0 μg/mL,1.0～32.0 μg/mL, 1.0～32.0 μg/mL,0.7～24.0 μg/mL, respectively, the recovery was 90%～103% and the precision was 3.5%～4.2%, the contents of four kinds of flavonoids in lotus leaves were respectively 1.94%, 0.092%, 0.025% and 0.021%. The proposed method was suitable for the determination of hyperoside, quercetin,kaempferol and isorhamnetin in lotus leaves.

lotus leaves; flavonoids; HPLC

2014-11-19； 2015-04-19修回

四川省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目“荷葉黃酮提取、分離和測(cè)定方法構(gòu)建及其體外抗前列腺癌作用研究”(2014-K-114)

孫 敏(1988-)，女，在讀碩士，研究方向：分析檢測(cè)及提取方法。E-mail:sunmin723@163.com

*通訊作者:張麗萍(1964-)，女，教授，從事分析檢測(cè)及提取方法的研究工作。E-mail: zlp666111@126.com

1001-3601(2015)05-0240-0072-03

R284.3

A