徐 佳

(貴州民族大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

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果蠅抗菌肽DiptericinA基因的原核表達(dá)及其抑菌活性

徐 佳

(貴州民族大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

為成功獲得具有生物活性的Diptericin蛋白，利用RT-PCR方法從果蠅體內(nèi)獲得DiptericinA基因，經(jīng)PCR、雙酶切、序列測(cè)定等方法確認(rèn)構(gòu)建原核表達(dá)載體的正確性；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，Ampicillin抗性篩選工程菌株，經(jīng)二步親和層析純化以及凝血酶切純化后進(jìn)行抑菌測(cè)驗(yàn)。結(jié)果表明：獲得DiptericinA基因；成功構(gòu)建原核表達(dá)載體；在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)Diptericin A-GST融合蛋白的胞內(nèi)可溶性表達(dá)，表達(dá)量為315.4 mg/L；獲得Diptericin A抗菌肽單體，純度達(dá)90%；抑菌檢測(cè)證明，Diptericin A對(duì)大腸桿菌具有明顯抑制活性，且呈劑量依賴性。

DiptericinA； 原核表達(dá)； 抑菌活性； 果蠅； 原核表達(dá)

果蠅缺乏哺乳動(dòng)物具有的獲得性免疫系統(tǒng)，也無(wú)抗體和補(bǔ)體系統(tǒng)，但成蟲果蠅卻能成為酵母、細(xì)菌和真菌的傳播載體，使有機(jī)體腐爛或變壞，這主要是因?yàn)楣壍奶烊幻庖呦到y(tǒng)可以抵制各種病原微生物的侵染[1]。果蠅免疫反應(yīng)的一個(gè)重要特點(diǎn)是在受到病原微生物侵染或損傷時(shí)，脂肪體細(xì)胞能快速合成一些抗菌肽，這些分子分泌到血淋巴后能殺死入侵的病原微生物[2]。另外，果蠅的氣管和上皮細(xì)胞等也能產(chǎn)生抗菌肽，而腸細(xì)胞和唾腺細(xì)胞等能產(chǎn)生溶菌酶和昆蟲防御素等抗菌蛋白[3-5]。到目前為止，在果蠅基因組中已發(fā)現(xiàn)超過(guò)30種編碼抗菌肽的基因，目前已有Attacin、Cecropin及Andropin[6-8]的表達(dá)研究，但對(duì)于成功獲得具有生物活性的Diptericin尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)黑腹果蠅的天然抗菌肽Diptericin A進(jìn)行表達(dá)，測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物是否具有抑殺大腸桿菌的活性，為開(kāi)發(fā)新型抗菌肽藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)由上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院飼養(yǎng)，大腸桿菌TOP10、大腸桿菌BL21和金黃色葡萄球菌ATCC6538由上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存。

Ex.Taq酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、RT-PCR試劑盒、小量膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒、原核載體pGEX-4T-1購(gòu)自Takara，Trizol、Ampicillin試劑購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，IPTG購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，GST-sepharose 4B購(gòu)自Amersham Pharmacia Biotech，氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽、十二烷基肌氨酸鈉購(gòu)自上海華舜生物有限公司，凝血酶(Thrombin，10U/mg)購(gòu)自上海永吉生物有限公司，CNBr-activated Sepharose 4B購(gòu)自Amersham Biosciences，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 果蠅總RNA的提取

液氮研磨大腸桿菌(E.coli)飼喂的3齡果蠅20～30只3次，按Trizol試劑盒說(shuō)明提取總RNA。

1.3DiptericinA的PCR擴(kuò)增

根據(jù)DiptericinA的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)其上下游引物D1、D2，在D1的5′端引入限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I的酶切位點(diǎn)，在D2的5'端引入終止子和限制性核酸內(nèi)切酶XhoI的酶切位點(diǎn)。上游引物D1為5′-CCGGAA TTC GAC GAC ATG ACC ATG AAG CC-3′，下游引物D2為5′-CCG CTC GAG CTA TTA GAA ATT CGG AAA TC-3′；以從果蠅中提取的總RNA為模板，用上下游引物兩步法RT-PCR分別擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表，RT-PCR反應(yīng)程序第一步是30℃ 10 min，47℃ 30 min，5℃ 5 min；RT-PCR第二步反應(yīng)程序是85℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)25次。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將目的條帶從膠上切下，然后用小量膠回收試劑盒回收純化。

表 兩步法RT-PCR的反應(yīng)體系

1.4 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Diptericin A的構(gòu)建

將質(zhì)粒pGEX-4T-1與經(jīng)RT-PCR產(chǎn)物用EcoR I和XhoI雙酶切，用T4DNA連接酶連接雙酶切得到的pGEX-4T-1和目的基因片段，形成閉合環(huán)狀的重組質(zhì)粒，命名為pGEX-4T-1-Diptericin A。

第三，充分利用互聯(lián)網(wǎng)和新興媒體，開(kāi)通多層次、多渠道的營(yíng)銷網(wǎng)絡(luò)，加大互聯(lián)網(wǎng)促銷力度，形成直銷和代理相結(jié)合的特色營(yíng)銷渠道。

用表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，涂布于含Ampicillin的LB平板上，挑選單菌落接入3 mL含Ampicillin的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃250 r/min下振蕩培養(yǎng)12～16 h，然后用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。用EcoRI和XhoI作雙酶切鑒定，構(gòu)建正確的重組大腸桿菌及時(shí)用含15%～20%甘油的LB培養(yǎng)基，于-20℃保存。

1.5 重組融合蛋白的高效表達(dá)

將重組大腸桿菌接種于5 mL 2×YT培養(yǎng)基中(含Amp 100 μg/mL)，37℃振搖過(guò)夜，培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6。取500 μL過(guò)夜培養(yǎng)物加至50 mL含100 μg/mL Ampicillin的2×YT液體培養(yǎng)基中。37℃搖床培養(yǎng)至OD600到0.6時(shí)(約3 h)，加入100 mmol/L IPTG儲(chǔ)液至終濃度為1.0 mmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后離心，收集發(fā)酵后的上清培養(yǎng)基、胞質(zhì)蛋白以及包涵體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.6 融合蛋白的分離純化

選用表達(dá)載體pGEX-4T-1含有編碼GST的序列，其下游有編碼凝血酶識(shí)別位點(diǎn)的序列，使表達(dá)的GST融合蛋白經(jīng)凝血酶酶切后即可釋放單體多肽。

通過(guò)GST-sepharose 4B親和層析柱純化融合蛋白，用Bradford法測(cè)定各步流出液蛋白質(zhì)的濃度，SDS-PAGE檢測(cè)純度。由此得到較高純度的重組融合蛋白溶液，于-80℃保存待用。將m融合蛋白∶m凝血酶=120∶1的比例混合，4℃下反應(yīng)16 h，切割融合蛋白。通過(guò)GST親和層析除去切割下的GST和未被切割的融合蛋白，獲得純度較高的單體多肽。

1.7 生物活性的測(cè)定

2 結(jié)果與分析

2.1DiptericinA的擴(kuò)增產(chǎn)物

由圖1可見(jiàn)，以引物D1和D2進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)25個(gè)循環(huán)后分別得到1個(gè)約280 bp的條帶，大小與理論值273 bp(包括編碼83個(gè)氨基酸殘基的Diptericin A成熟肽基因序列249 bp、引物設(shè)計(jì)增加24 bp)基本一致。將片段構(gòu)建原核表達(dá)載體后，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)基因序列的正確性。

注：1,2為DiptericinA基因的RT-PCR產(chǎn)物；3為marker。

Note：1 and 2, RT-PCR products ofDiptericinAgene; 3, marker.

圖1 RT-PCR擴(kuò)增果蠅DiptericinA基因圖譜

Fig.1 Amplification ofDiptericinAgene of Drosophila melanogaster by RT-PCR

2.2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Diptericin A

PCR及雙酶切鑒定結(jié)果得到1個(gè)273 bp的DiptericinA片段和1個(gè)4 900 bp的pGEX-4T-1質(zhì)粒片段，表明目的片段正確插入表達(dá)質(zhì)粒(圖2)。測(cè)序結(jié)果證實(shí)其目的片段的正確性。

2.3 重組融合蛋白的表達(dá)

由圖3表明，在裂解菌體上清中獲得35 KD可溶的重組融合蛋白Diptericin A-GST，說(shuō)明Diptericin A-GST能實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)可溶性表達(dá)。

注：1為重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Diptericin A，2為重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Diptericin A用EcoRI和XhoI雙酶切，3為重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Diptericin A的PCR產(chǎn)物，4、5為marker。

Note：1, Recombinant plasmid pGEX-4T-1-Diptericin A; 2, Recombinant plasmid pGEX-4T-1-Diptericin A digested byEcoRIandXhoI; 3, PCR product of recombinant plasmid pGEX-4T-1-Diptericin A; 4 and 5, Marker.

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Diptericin A的鑒定

Fig.2 Identification of recombinant plasmid pGEX-4T-1-Diptericin A

注：1為發(fā)酵后上清培養(yǎng)基中的蛋白，2為發(fā)酵后胞質(zhì)蛋白，3為marker，4為包涵體蛋白。

Note：1, Protein in supermatant medium after fermentation; 2, Cytoplasmic protein after fermentation; 3, Marker; 4, Inclusion body protein.

圖3 融合蛋白Diptericin A- GST的表達(dá)產(chǎn)物定位

Fig.3 Location of expression product of fusion protein Diptericin A- GST

2.4 重組融合蛋白Diptericin A- GST的分離純化

由圖4可見(jiàn)，已成功獲得純度較高的Diptericin A-GST融合蛋白，其純度可達(dá)95%。經(jīng)Bradford法檢測(cè)，產(chǎn)量為315.4 mg/L。

注：1為洗脫液，2為marker，3為上樣流出液，4為PBS洗雜液。

Note：1, Eluant; 2, Marker; 3, Outflow of upper sample; 4, PBS wash liquid.

圖4 融合蛋白Diptericin A-GST的純化

Fig.4 Purification of fusion protein Diptericin A-GST

注：1為純化后的抗菌肽Diptericin A單體，2為marker。

Note：1，Purified Diptericin A monomer; 2, Marker.

圖5 抗菌肽Diptericin A的純化

Fig.5 Purification of Diptericin A

2.5 融合蛋白Diptericin A-GST的酶切及抗菌肽Diptericin A的純化

將酶切混合溶液與GST-sepharose4B親和層析柱結(jié)合，流出液中含有的未結(jié)合蛋白即目的蛋白Diptericin A，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，Diptericin A單體蛋白的純度約為90%(圖5)。

2.6 Diptericin A的生物活性

不同濃度的Diptericin A溶液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈大小分別為20.5 mm、15.00 mm和9.00 mm(圖6)。

注：0為PBS對(duì)照孔，1為1 mg/mL Diptericin A溶液加樣孔，2為2 mg/mL Diptericin A溶液加樣孔，3為4 mg/mL Diptericin A溶液加樣孔。

Note: 0, PBS control pore; 1, Sampling pore of 1 mg/mL Diptericin A solution; 2, Sampling pore of 2 mg/mL Diptericin A solution; 3, Sampling pore of 4 mg/mL Diptericin A solution.

圖6 Diptericin A對(duì)大腸桿菌的抑菌圈

Fig.6 Inhibition zone of Diptericin A againstE.coli

Diptericin A對(duì)大腸桿菌具有抑殺活性，并且該作用呈劑量依賴性。在以金黃色葡萄球菌為陰性對(duì)照的抑菌圈試驗(yàn)中，未觀察到抑菌圈，因金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，因此結(jié)果與前人結(jié)論一致[9-11]，即昆蟲體內(nèi)的富含甘氨酸抗菌肽類對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌具有抑殺作用，但不作用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。抑菌試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明， Diptericin A具有抑殺革蘭氏陰性菌的生物活性。

3 結(jié)論與討論

因抗菌肽具有廣譜的抗菌作用，并且微生物對(duì)其拮抗作用非常小，隨著越來(lái)越多傳統(tǒng)抗生素耐藥性細(xì)菌菌株的出現(xiàn)，抗菌肽可能成為一類抗微生物或抗脂多糖新型藥物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[12-14]。但生物體中抗菌肽含量較低，且從生物體內(nèi)直接提取的難度大，對(duì)技術(shù)和成本的要求高，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，化學(xué)合成方法同樣存在成本較高的問(wèn)題，因此基因重組技術(shù)成為大量表達(dá)有活性抗菌肽的一條有效途徑。

本研究采用的表達(dá)載體pGEX-4T-1含有tac啟動(dòng)子，有利于融合蛋白的誘導(dǎo)及高水平表達(dá)，并且具有氨芐抗性，在其編碼GST序列的下游含有編碼凝血酶酶切位點(diǎn)的序列。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，表達(dá)產(chǎn)物N端融合了GST蛋白，用凝血酶酶切后即可得到單體蛋白。該載體的使用可以起到以下3個(gè)作用：增加外源蛋白的穩(wěn)定性，提高外源基因在宿主中的表達(dá)水平，有利于目的蛋白的分離純化。

試驗(yàn)證明，本研究成功獲得果蠅抗菌肽Diptericin A，并具有一定的抑菌活性，為進(jìn)一步研究其對(duì)機(jī)體免疫力方面的影響提供可能。在大腸桿菌中成功表達(dá)具有活性的Diptericin A為利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究抗菌肽的作用機(jī)理和開(kāi)發(fā)新型抗感染藥物開(kāi)辟一條新途徑。

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(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Prokaryotic Expression ofDiptericinAGene and Its Antimicrobial Activity inDrosophilamelanogaster

XU Jia

(GuizhouMinzuUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

DiptericinAgene was amplified from total Drosophila RNA by RT-PCR and then the correctness of established prokaryotic expression vector was determined by PCR, double-enzyme digestion and sequencing methods. The recombinant plasmid was transformed into BL21 and then strains with resistance to Ampicillin were screened. The results showed thatDiptericinAgene is obtained and the prokaryotic expression vector is established successfully. Diptericin A-GST is expressed in the form of soluble GST fusion protein with a yield of 315.4 mg/L. Diptericin A antibacterial peptide monomer with 90% purity is obtained. The bacteriostat test showed that Diptericin A has the significant inhibition effect onE.coliand the effect is dose-dependent.

DiptericinA; prokaryotic expression; bacteriostatic activity；Drosophilamelanogaster; prokaryotic expression

2015-04-14； 2015-05-01修回

貴州省科技廳貴州民族大學(xué)聯(lián)合基金項(xiàng)目“貴州地區(qū)奶牛乳房炎主要病原菌調(diào)查及其生物防治方法研究”[黔科合J字KM(2012)01]

徐 佳(1982-)，女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事蛋白藥物研究。E-mail:50424567@qq.com

1001-3601(2015)05-0228-0024-04

S443.9

A