朱丹丹， 王培丹， 林興生， 林 輝， 蘇德偉， 林占熺*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002； 2.國家菌草工程技術(shù)研究中心， 福建 福州 350002)

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象草和巨菌草的核型分析

朱丹丹1， 王培丹1， 林興生2， 林 輝2， 蘇德偉2， 林占熺2*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002； 2.國家菌草工程技術(shù)研究中心， 福建 福州 350002)

為巨菌草的種質(zhì)鑒定、遺傳育種和親緣關(guān)系提供一定的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，采用傳統(tǒng)壓片法，對象草(Pennisetumpurpureumschumach)和巨菌草〔Pennisetumgiganteumz.x.lin(暫定名)〕的染色體數(shù)目及核型進(jìn)行分析。結(jié)果表明：象草和巨菌草的染色體形態(tài)較為一致，大部分由中部(m)和近中部(sm)著絲粒的染色體組成，象草和巨菌草的核型公式分別為2 n=4 x=28=20 m+8 sm和2 n=4 x=28=16 m+8 sm+4 st；染色體相對長度組成分別為2 n=4 x=28=6 L+6 M2+10 M1+6 S和2 n=4 x=28=4 L+8 M2+10 M1+6 S，染色體基數(shù)和總數(shù)目一致，核型分類均為2 A型，不對稱系數(shù)為58%～60%，均屬于較原始的類型。結(jié)論：象草和巨菌草的的染色體無明顯差異性，從細(xì)胞染色體水平上認(rèn)為兩者親緣關(guān)系較近。

象草； 巨菌草； 染色體； 核型

在遺傳多樣性分析研究中，不僅有形態(tài)學(xué)分析、細(xì)胞學(xué)分析、分子標(biāo)記等常規(guī)方法，同時還包括流式細(xì)胞技術(shù)和熒光原位雜交等新技術(shù)被廣泛運(yùn)用。植物染色體信息與植物的其他特性相比，不同的是其能保持一致性，因此在植物分類學(xué)、進(jìn)化分析學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)方面是較為關(guān)鍵的參數(shù)[11]。目前，關(guān)于狼尾草屬(Pennisetum)植物核型方面的研究已有報道，如周自瑋等[12]研究了云南德宏地區(qū)逸生狼尾草(NaturalizedPennisetumsp.)的分類學(xué)鑒定，張倫等[13]對長序狼尾草(PennisetumlongissimumS.L.Chen et Y. X. Jin)的核型進(jìn)行了分析。但前人的研究只是對狼尾草屬植物染色體數(shù)目及基數(shù)的確定，并未對其染色體的著絲粒組成、染色體長度組成、核型類型劃分等進(jìn)行相關(guān)的細(xì)胞核型分析。目前，從國外引進(jìn)的狼尾草屬植物較多，常出現(xiàn)同名異物和同物異名的現(xiàn)象。因此，筆者以象草和巨菌草為試驗(yàn)材料，通過對其進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)觀察以及核型分析，深入探討2種植物之間的親緣關(guān)系，并為其遺傳育種、引種以及巨菌草種的起源進(jìn)化、系統(tǒng)分類等提供一定的細(xì)胞學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

象草和巨菌種植于福建農(nóng)林大學(xué)菌草研究所菌草圃。

1.2 材料處理

選取長勢較好的象草和巨菌草，將其莖每2節(jié)截成段，浸入盛有清水的桶中培養(yǎng)生根，每2 d換1次清水，pH自然條件下培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞染色體制片

選取生長旺盛的根尖(1 cm左右)，離體處理后即刻放入0.05%秋水仙素溶液中2 h，用卡諾氏固定液(V無水乙醇∶V乙酸=3∶1)固定24 h，預(yù)處理后將材料置1 mol/L鹽酸常溫解離10 min。水洗約10 min，轉(zhuǎn)入改良苯酚品紅染色液中染色1～2 h。去染液，用蒸餾水洗約30 min后，再用2%纖維素酶和果膠酶(質(zhì)量比2∶1)混合液在37℃恒溫箱中解離30～60 min。清水洗去酶液后，再用卡諾氏固定液固定10 min，最后用45%乙酸或稀改良苯酚品紅染色液染色和壓片[14]。

1.4 顯微鏡觀察

在新時代發(fā)展期，以“軟性協(xié)商”為核心的“軟治理”方式可有效解決矛盾沖突，達(dá)成多方共贏的局面。對于城市社區(qū)而言，可應(yīng)用調(diào)解、協(xié)商、討論、引導(dǎo)、說服等靈活手段和較強(qiáng)的談判指導(dǎo)功能，化解社會矛盾，實(shí)現(xiàn)城市社區(qū)的共同治理[27]。對于新農(nóng)村社區(qū)而言，可在“軟法和軟權(quán)力”的基礎(chǔ)上，利用心理疏導(dǎo)、人文關(guān)懷等“柔性”執(zhí)法手段，實(shí)現(xiàn)鄉(xiāng)村社會的治理有序[28]。而本文所提及的基于壓力型體制形成的“不出事治理術(shù)”，其實(shí)即是新時期一種以“軟手段”為實(shí)踐表征的權(quán)宜性治理策略。

將象草和巨菌草根尖細(xì)胞臨時裝片，利用尼康NI-U型號顯微鏡觀察，在低倍鏡(100倍)下找到視野后用油鏡(1000倍)觀察，選擇細(xì)胞分裂中期，染色體較粗、分散、數(shù)目全的染色體進(jìn)行顯微攝影，2種草各選擇30個染色體分散良好、輪廓清晰、數(shù)目較全的細(xì)胞染色體中期相拍照。

1.5 核型分析及相關(guān)公式

分別選擇30個象草和巨菌草細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目計數(shù)，核型取30個細(xì)胞的平均值。核型分析按照李懋學(xué)與陳瑞陽[15]方法，染色體排序參照Levan等[16]提出的命名系統(tǒng)，染色體相對長度系數(shù)用Kuo等[17]的方法計算，核型不對稱系數(shù)按Arano[18]提出的方法確定，核型分類按照Stebbins[19]的分類標(biāo)準(zhǔn)。利用核型分析軟件Karyo3.1(美國東樂自然基因生命科學(xué)公司提供)處理圖片、確定著絲粒位置及測量染色體長臂和短臂，統(tǒng)計染色體數(shù)目，計算下列值，排序和編號染色體，并劃定染色體類型。相關(guān)公式如下：

臂比(r)=長臂(S)/短臂(L)

染色體相對長度=(染色體長度/染色體組總長度)×100%

染色體相對長度指數(shù)(I.R.L)=染色體長度/全組染色體平均長度

核型不對稱系數(shù)(As.k, %)=(長臂總長/全組染色體總長)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 象草的細(xì)胞染色體

由圖1可見，其中的細(xì)胞染色體數(shù)目為28條、26條和30條分別有25個、2個和3個細(xì)胞，細(xì)胞分別占計數(shù)總數(shù)的83.3%、7.7%和10%。根據(jù)核型分析的標(biāo)準(zhǔn)化建議[23]，確定象草的染色體數(shù)目為2n=4x=28。

2.2 象草的核型

由表1和表2可知，象草染色體的數(shù)目為2 n=4 x=28，其中，第3號、第4號、第11號、第12號為近中部著絲粒染色體(sm)，其余均為中部著絲粒染色體(m)。核型公式為2 n=4 x=28=20 m+8 sm。細(xì)胞染色體相對長度為3.31%～12.28%，其組成為2 n=4 x=28=6 L+6 M2+10 M1+6 S，最長和最短染色體比為3.71，染色體臂比大于2∶1的染色體占6.67%，按照Stebbins[19]提出的核型分類標(biāo)準(zhǔn)，象草的核型屬于2A型，核型不對稱系數(shù)為58.77%。

注：a為象草染色體中期相，b為象草核型圖。

Note: a, Metaphase phase of chromosomes; b, chart of chromosome karyotype.

圖1 象草染色體中期相和核型圖

Fig.1 Metaphase chromosomes and karyotype ofP.purpureum

表1 象草的染色體核型參數(shù)

表2 象草與巨菌草染色體的核型特征

2.3 巨菌草的細(xì)胞染色體

由圖2可見，30個巨菌草染色體分散較好的細(xì)胞染色體數(shù)目為28條和26條分別有28個和2個細(xì)胞，分別占計數(shù)總數(shù)的93.3%和7.7%，按照核型分類標(biāo)準(zhǔn)[23]，最終確定巨菌草染色體數(shù)目為2n=4x=28。

2.4 巨菌草的核型

由表2和表3可知，巨菌草染色體的數(shù)目為2 n=4 x=28，其中第3號、第4號、第11號、第12號為近中部著絲粒染色體(sm)，第13號、第14號為近端部著絲粒染色體(st)，其余均為中部著絲粒染色體(m)。核型公式為2 n=4 x=28=16 m+8 sm+4 st。核染色體相對長度在4.13%～11.78%，其組成為2 n=4 x=28=4 L+8 M2+10 M1+6 S，最長和最短染色體比為2.85，染色體臂比大于2∶1的染色體占6.67%。按照核型分類標(biāo)準(zhǔn)，巨菌草的核型屬2A型，核型不對稱系數(shù)為59.86%。

注：a為巨菌草染色體中期相，b為巨菌草核型圖。

Note: a, metaphase phase of chromosomes; b, chart of chromosome karyotype.

圖2 巨菌草染色體中期相和核型圖

Fig.2 Metaphase chromosomes and karyotype pairs ofP.giganteum

表3 巨菌草的染色體核型參數(shù)

3 結(jié)論與討論

每一個物種染色體的結(jié)構(gòu)、數(shù)目和形態(tài)不同。象草和巨菌草的體細(xì)胞染色體總數(shù)目均為2 n=4 x=28，無隨體現(xiàn)象出現(xiàn)。其中象草的核型公式為2 n=4 x=28=20 m+8 sm，相對長度為3.31%～12.28%，組成為2 n=4 x=28=6 L+6 M2+10 M1+6 S，屬于2A型，核型不對稱系數(shù)為58.77%；巨菌草核型公式為2 n=4 x=28=16 m+8 sm+4 st，相對長度為4.13%～11.78%，組成為2 n=4 x=28=4 L+8 M2+10 M1+6 S，也屬于2A型，不對稱系數(shù)為59.86%。兩者的核型不對稱系數(shù)為58%～60%，具有較高的對稱性，表明在進(jìn)化上屬于比較原始的類型。普遍認(rèn)為，在植物界中細(xì)胞核型進(jìn)化的基本趨勢由對稱向不對稱發(fā)展[19]，巨菌草的核型不對稱系數(shù)略大于象草，說明巨菌草的進(jìn)化程度比象草高，此結(jié)論國內(nèi)鮮有報道。

一般來說，核型數(shù)據(jù)如染色體的數(shù)目、倍性、相對長度、隨體的數(shù)量及位置等參數(shù)均是鑒定種和亞種的重要理論依據(jù)[20-25]。周自瑋等[12]研究云南德宏地區(qū)逸生狼尾草的體細(xì)胞染色體為2 n=4 x=28，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，由此推斷云南地區(qū)的逸生狼尾草與巨菌草、象草親緣關(guān)系較近。閻貴興等[26]在禾本科7屬33種飼用植物的染色體研究結(jié)果中表明其基數(shù)均為7，且均由m和sm染色體組成〔東方早麥草(Eremopyrum orientale (Linn.) Jaub. et Spach)例外〕，多數(shù)種類核型對稱程度較高，與本試驗(yàn)結(jié)果大體一致。有研究表明，狼尾草屬的狼尾草，其染色體有2n=18、14、36，而象草染色體只有2n=28、56[27]，可推斷巨菌草與象草是不同的象草品種類型。另據(jù)巨菌草的 rDNA ITS 序列測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巨菌草與牧草蔗、萊牧1號的同源性達(dá)92.1%，推測巨菌草是雜交狼尾草的一個品種[28]。結(jié)合核型分析結(jié)果以及分子方面的研究，可推斷巨菌草隸屬狼尾草屬，且與象草的親緣關(guān)系較近。但與前人結(jié)果不同的是，此材料沒有觀察到隨體，這可能與試驗(yàn)材料和染液有關(guān)。染色體上的著絲粒由于為人工設(shè)定，存在一定誤差，故需要進(jìn)一步將染色體C帶分析、原位雜交等技術(shù)運(yùn)用于染色體研究，以期獲得更準(zhǔn)確的細(xì)胞學(xué)信息。同時對巨菌草的研究應(yīng)結(jié)合細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)記等方面的研究方法，為鑒定此品種提供更加詳盡和準(zhǔn)確的生物學(xué)信息，以達(dá)到巨菌草的育種、推廣以及種質(zhì)資源保護(hù)的目的。

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(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Karyotype Analysis ofPennisetumpurpureumandPennisetumgiganteum

ZHU Dandan1, WANG Peidan1, LIN Xingsheng2, LIN Hui2, SU Dewei2, LIN Zhanxi2*

(1.CollegeofLifeScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002; 2.ChinaNationalEngineeringResearchCenterofJuncaoTechnology,Fuzhou,Fujian350002,China)

To provide certain cellular basis for germplasm, breeding and genetic kinship ofP.giganteum, The karyotype analysis and chromosome number ofP.purpureumandP.giganteumwere conducted by traditional squash method. The results showed that the karyotype morphology of materials were similar, consisted of metacentric chromosomes and sub-metacentric chromosomes mostly. In this study, the karyotype formulas ofP.purpureumandP.giganteumwere respectively 2 n=4 x=28=20 m+8 sm, 2 n=4 x=28=16 m+8 sm+4 st. Constitutions of relative length of two plants were 2 n=4 x=28=6 L+6 M2+10 M1+6 S, 2 n=4 L+8 M2+10 M1+6S. The karyotype ofP.purpureumwas the same as that ofP.giganteumin chromosome basic number and total number. And two varieties were classed as 2A. The asymmetry coefficient were in the range of 58% to 60%, which demonstrated basic symmetry karyotypes. Conclusion: Both of the two plants had no significant differences in chromosomes between them and the relationship between them was close from cellular level.

Pennisetumpurpureum;Pennisetumgiganteum; chromosome; karyotype

2015-01-26； 2015-04-29修回

福建省科技重大專項“水土流失初步治理區(qū)生態(tài)循環(huán)與產(chǎn)業(yè)提升技術(shù)研發(fā)與示范”(2012NZ0002)；科技部項目“國家菌草工程技術(shù)研究中心組建”(2011FU125X12)

朱丹丹(1989-)，女，在讀碩士，研究方向:植物遺傳學(xué)研究。E-mail:1042527543@qq.com

*通訊作者：林占熺(1943-)，男，研究員，博士生導(dǎo)師，聯(lián)合國國際生態(tài)安全科學(xué)院院士，從事菌草研究。E-mail:linjuncao@163.com

1001-3601(2015)05-0226-0014-05

Q949

A