黃亞瓊， 趙慶麗， 張鋒軍， 顧麗萍

(中國人民解放軍蘭州軍區(qū)總醫(yī)院乳腺科， 甘肅 蘭州 730050)

腫瘤的產(chǎn)生是多步驟、多因素參與的結(jié)果，其中腫瘤細(xì)胞使機(jī)體形成的免疫耐受在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。正常組織細(xì)胞在發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的過程中都會出現(xiàn)一些異常物質(zhì)表達(dá)或正常物質(zhì)表達(dá)量的改變，而在機(jī)體免疫功能正常的情況下這些異常物質(zhì)會激活免疫相關(guān)的特異性T細(xì)胞［1］，以清除這些發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，防止腫瘤的發(fā)生。人體中幾乎所有的腫瘤均存在相應(yīng)的逃避免疫監(jiān)視機(jī)制［2］，因此研究腫瘤免疫耐受產(chǎn)生機(jī)制，對于腫瘤的免疫治療、腫瘤預(yù)防有重大意義［3］。多項研究顯示［4］，髓系來源抑制細(xì)胞中吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)表達(dá)，可能參與腫瘤免疫耐受的形成，但對于髓系來源的抑制細(xì)胞是如何導(dǎo)致腫瘤免疫耐受產(chǎn)生的機(jī)制仍不甚了解。本研究分析腫瘤組織中免疫抑制細(xì)胞IDO表達(dá)與Foxp3+Tregs分布的關(guān)系，初步探索乳腺癌免疫耐受形成的相關(guān)可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料:選取我院腫瘤乳腺外科2009年6月至2012年9月病例120例，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性導(dǎo)管侵潤癌，患者均為女性，年齡在30-64歲，平均48歲;絕經(jīng)68例，未絕經(jīng)52例;組織學(xué)分級:Ⅰ級24例，Ⅱ級50例，Ⅲ級46例;臨床分期:Ⅰ期20例，Ⅱ期74例，Ⅲ期26例;手術(shù)取樣，術(shù)前所有患者均未接受任何放療及化療治療。

1.2 方 法

1.2.1 免疫組化單染SP法:將獲得的乳腺癌標(biāo)本石蠟包埋、切片。常規(guī)免疫組化染色，脫蠟后去除內(nèi)源性過氧化物酶，沖洗后進(jìn)行切片修復(fù)、暴露，依次滴加特異性一抗、二抗并孵育，最后在切片上滴加DAB顯色并用蘇木素復(fù)染。

1.2.2 免疫組化雙染SP法:采用免疫組化雙染技術(shù)，試劑來自美國 California Biotech Inc公司，對樣本CD33+MDSCs中IDO表達(dá)情況進(jìn)行檢測，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.3 免疫組化的結(jié)果評定:由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生分別雙盲閱片，在高倍鏡(400*)下隨機(jī)選取10個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。按陽性細(xì)胞在所占細(xì)胞百分比計分:小于5%計0分;6%-25%計1分;26%-50%計2分;51%-75%計3分;大于75%計4分。規(guī)定0-2分為表達(dá)缺失，大于2分則為陽性表達(dá)。CD33定位于胞漿和胞核，F(xiàn)oxp3主要定位于胞核，如存在二者表達(dá)，則細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度棕黃色。乳腺癌標(biāo)本中，免疫組化雙染陽性細(xì)胞均呈現(xiàn)為胞漿淡紅色、胞核紫黑。CD33+MDSCs樣本中IDO的表達(dá)情況統(tǒng)計，仍按上述統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)記錄。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析:采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料、率的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢測水準(zhǔn)設(shè)定為 0.05。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌癌組織中MDSCs IDO表達(dá)與臨床病理之間的聯(lián)系:癌組織中MDSCs IDO的表達(dá)與患者年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤大小和組織學(xué)分級無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，但與腫瘤是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系(P＜0.05)。見表1。

2.2 乳腺癌中CD33+MDSCs IDO表達(dá)與Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)分布的關(guān)系:癌組織中CD33+MDSCs IDO表達(dá)的樣本Foxp3+Tregs分布比例也較高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表1 乳腺癌中MDSCs中IDO表達(dá)與臨床病理之間的聯(lián)系 n(%)

表2 CD33+MDSCs IDO表達(dá)與Foxp3+Tregs分布之間的影響

3 討論

腫瘤對正常機(jī)體來說是一種異物，必然會引起特異性免疫反應(yīng)，對腫瘤細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用。但許多研究表明［5］，在腫瘤發(fā)生后機(jī)體的免疫系統(tǒng)并不針對腫瘤產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)清除腫瘤細(xì)胞，這表明患者機(jī)體對腫瘤存在產(chǎn)生了免疫耐受。本研究前期觀察中我們發(fā)現(xiàn)，乳腺癌癌組織中CD33+MDSCs表達(dá)的IDO，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)免疫抑制，且其表達(dá)水平的高低跟乳腺癌患者預(yù)后密切相關(guān)［6，7］。肝癌的相關(guān)研究［8］中也發(fā)現(xiàn)IDO表達(dá)高低與肝癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，推測其可以作為判斷肝癌預(yù)后的指標(biāo)之一。MDSCs細(xì)胞來源于骨髓中不同發(fā)育階段的抗原呈遞細(xì)胞，最早在老鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)［9］，已有多項研究證明MDSCs能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫耐受的產(chǎn)生。

IDO是存在于細(xì)胞內(nèi)的一種免疫抑制酶，專門由樹突細(xì)胞及其他髓樣細(xì)胞表達(dá)，能夠降解特異性T細(xì)胞增值所必須的色氨酸，并生成一些具有細(xì)胞毒作用的中間產(chǎn)物，抑制機(jī)體免疫功能。前期研究表明，低濃度色氨酸會使特異性T細(xì)胞的增值留在G1期，防止特異性免疫反應(yīng)激活，Inaba等在研究60例卵巢癌患者及體外小鼠腫瘤模型發(fā)現(xiàn)，加入IDO抑制劑1-甲基色氨酸后(1-MT)能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長。Nakanura等通過研究子宮頸癌患者病理標(biāo)本后發(fā)現(xiàn)，表達(dá)IDO的癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力。癌組織中CD33+MDSCs IDO的表達(dá)明顯升高，這有利于降低癌組織局部色氨酸濃度，使機(jī)體對腫瘤細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)抗原產(chǎn)生免疫耐受。這可能是腫瘤免疫耐受形成的重要機(jī)制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3+Tregs高比例樣本中 CD33+MDSCs IDO表達(dá)水平也明顯升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明癌組織中CD33+MDSCs IDO 表達(dá)，可能能夠募集調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3+Tregs進(jìn)入癌組織，介導(dǎo)腫瘤免疫耐受的產(chǎn)生。研究結(jié)果還顯示MDSCs中IDO表達(dá)水平在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中比例明顯升高(P＜0.05)，表明IDO的表達(dá)可能與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與國外研究腺病毒轉(zhuǎn)移的IDO角化細(xì)胞侵蝕性明顯增強(qiáng)相一致。闡明乳癌中MDSCs中IDO表達(dá)跟腫瘤耐受產(chǎn)生的分子生物學(xué)機(jī)制，有助于明確乳癌的發(fā)病機(jī)制，為免疫治療、基因治療提供必要的理論依據(jù)，對乳癌患者預(yù)后的監(jiān)測都有重要意義。

［1］ Schreiber RD，Old LJ，Smyth MJ.Cancer immunoediting:integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion［J］.Science，2011，331(6024):1565-1570.

［2］ 余宗林，李中琴.乳腺癌微轉(zhuǎn)移的檢測及臨床意義［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，8(1):134-136.

［3］ 陸作潔.首發(fā)為血液系統(tǒng)表現(xiàn)的骨髓轉(zhuǎn)移癌39例分析［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10(7):841-842.

［4］ Movahedi K，Guilliams M，Van den Bossche J，et al.Identification of discrete tumor-induced myeloid-derived suppressor cell subpopulations with distinct T cell-suppressive activity［J］.Blood，2008，111(8):4233-4244.

［5］ Jessiea B.Katz，Alexander J.Muller，GeorgeC.Prendergast Indoleamine 2，3-dioxygenasein Teell toleranee and tumoral imrnunee sea［J］.Immunologieal Reviews，2008，(222):206-221.

［6］ Baban B，Chandler PR，Sharma MD，et al.IDO activates regulatory T cells and blocks their conversion into Th17-like T cells［J］.Immunol，2009，183(4):2475-2483.

［7］ Godin-Ethier J，Hanafi LA，Piccirillo CA，et al.Indoleamine 2，3-dioxygenase expression in human cancers:clinical and immunologic perspectives［J］.Clin Cancer Res，2011，17(22):6985-6991.

［8］ 杜華勁，張月君，周彩云，等.Ki-67和p53在三陰性乳腺癌中的表達(dá)和意義［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2013，11(9):1393-1395.

［9］ Kusmartsev S，Su Z，Heiser A，et al.Reversal of myeloid cell-mediated immunosuppression in patients with metastatic renal cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2008，14(24):8270-8278.