洪英財(cái)， 陳懷生， 劉 均， 林少霖， 王 正， 楊 林， 王光鎖

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院胸外科， 廣東 深圳 518000)

近年來(lái)，肺癌已經(jīng)成為最常見(jiàn)的癌癥之一，同時(shí)其也是我國(guó)發(fā)病率及致死率最高的癌癥，根據(jù)2008我國(guó)肺癌統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，僅有15.8%的肺癌患者在確診后生存期能超過(guò)5年［1］。在所有肺癌病例中，非小細(xì)胞肺癌就已經(jīng)占到了4/5，是最為常見(jiàn)的肺癌類型。在治療非小細(xì)胞肺癌的藥物當(dāng)中，近年來(lái)，分子靶向藥物因其特異，高效，副作用小的特點(diǎn)而得到了廣泛推廣和臨床應(yīng)用。靶向治療是基于腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞分子存在差異化，而開(kāi)發(fā)的專一性藥物，因此它僅能對(duì)腫瘤的特有結(jié)構(gòu)或與腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳遞有關(guān)的受體、酶和蛋白等因子有效，從根本上殺死腫瘤細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)。所以給予靶向治療前，一定要確認(rèn)特定靶點(diǎn)基因的狀態(tài)，從而評(píng)估每位患者對(duì)特定藥物的敏感性和毒副反應(yīng)的大小，以確保在安全的前提下進(jìn)行用藥［2］。

Ion Torrent測(cè)序是第三代測(cè)序技術(shù)，其不但使DNA聚合酶自身反應(yīng)速度得到實(shí)現(xiàn)，能夠在1s即可測(cè)10個(gè)堿基，相對(duì)于化學(xué)法測(cè)序其效率顯著提高甚至超過(guò)2萬(wàn)倍，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)反應(yīng)的自身延續(xù)，對(duì)于蛋白質(zhì)片段的合成具有積極意義，顯著提高了基因組的重復(fù)序列的拼接的效率［3］。其能夠直接測(cè)RNA的序列，降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差［4］。并對(duì)甲基化的DNA序列進(jìn)行直接的測(cè)定，更好的提高了基因測(cè)序效率。從而實(shí)現(xiàn)了基因?qū)用鎸?duì)患者的外周血DNA進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行基因診斷和治療的可行性［5］。本研究主要通過(guò)Ion Torrent測(cè)序?qū)κ中g(shù)前后患者外周血DNA進(jìn)行檢測(cè)，以更好的為臨床腫瘤靶向治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下:

1 資料與方法

1.1 一般資料:選擇2012年8月至2014年2月醫(yī)院收治的非小細(xì)胞肺癌患者80例，所有患者均經(jīng)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查以及病理組織活檢確診，按照數(shù)字隨機(jī)法分為兩組，各40例，其中觀察組:男31例，女9例，年齡43－69歲，平均(54.3±2.9)歲，肺癌確診病程1－5年，平均(2.1±0.3)年;對(duì)照組:男32 例，女8 例，年齡42－69歲，平均(54.2±2.8)歲，肺癌確診病程1－5 年，平均(2.0±0.3)年。

1.2 入選及排除標(biāo)準(zhǔn):入組標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理組織學(xué)/細(xì)胞學(xué)檢查診斷為非小細(xì)胞肺癌;②年齡18歲－75周歲;③ECOG評(píng)分0－2分;④預(yù)計(jì)生存期≥2個(gè)月;⑤主要器官功能正常;⑥自愿入組，簽署知情同意書(shū)，依從性好，配合隨訪;⑦距離大手術(shù)4周以上。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并未能控制的中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，具有顱高壓表現(xiàn);②具有出血傾向，特別是1月內(nèi)出現(xiàn)過(guò)明顯的消化道出血;或正在接受溶栓或抗凝治療;③30d內(nèi)使用過(guò)其他研究藥物，或同時(shí)參加其他臨床研究;④6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)過(guò)心肌梗塞，或目前存在不穩(wěn)定性心絞痛、心功能不全;⑤合并嚴(yán)重慢性阻塞性肺病和/或呼吸衰竭;⑥雙側(cè)胸腔大量積液或包裹性胸腔積液;⑦患者依從性差，或患有精神疾病;⑧已知對(duì)本試驗(yàn)用藥及其輔料過(guò)敏;⑨目前存在未控制的嚴(yán)重感染。⑩妊娠期或哺乳期女性患者，不愿采取避孕措施的育齡患者(包括男性)。

1.3 Ion Torrent測(cè)序的工作原理:以基因組學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)采用新一代快速測(cè)序平臺(tái)－第三代測(cè)序技術(shù) Ion Torrent，來(lái)對(duì)非小細(xì)胞肺癌病人外周血循環(huán)DNA進(jìn)行檢測(cè)，探索其在個(gè)體化用藥指導(dǎo)上的價(jià)值。先將含測(cè)序的DNA樣本置入微孔，然后使用數(shù)量巨大的且未經(jīng)處理的核苷酸(DNTP)，依次穿過(guò)微孔;根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則DNA聚合酶會(huì)將相應(yīng)核苷酸置入延伸鏈，通過(guò)延伸反映獲得的氫離子直接改變反映體系的PH值，測(cè)序儀就可以這種變化為基礎(chǔ)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 研究方法及觀察指標(biāo):采集非小細(xì)胞肺癌病人外周血循環(huán)DNA，觀察組利用三代測(cè)序技術(shù)Ion Torrent檢測(cè)，對(duì)照組使用第1代測(cè)序技術(shù)Sanger末端終止法進(jìn)行測(cè)序，比較手術(shù)前后通過(guò)Ion Torrent測(cè)序所得EGFR和K－ras結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)兩組測(cè)序EGFR陽(yáng)性1年生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間均數(shù)的比較使用t檢驗(yàn)，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 未手術(shù)者Ion Torrent測(cè)序EGFR和K－ras結(jié)果比較:未手術(shù)者觀察組EGFR陽(yáng)性和K－ras突變陽(yáng)性檢出率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 未手術(shù)者Ion Torrent測(cè)序EGFR和K-ras結(jié)果比較 n(%)

2.2 術(shù)后復(fù)發(fā)患者Ion Torrent測(cè)序EGFR和K－ras結(jié)果比較:術(shù)后復(fù)發(fā)患者觀察組EGFR陽(yáng)性和K－ras突變陽(yáng)性檢出率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 兩組測(cè)序EGFR陽(yáng)性1年生存情況比較:觀察組1年死亡8例，生存率為80.0%，對(duì)照組1年死亡19例，生存率為52.5%，觀察組生存率顯著高于對(duì)照組(χ2=6.765，P=0.009)。

3 討論

在非小細(xì)胞腫瘤個(gè)體化用藥指導(dǎo)治療中，人們發(fā)現(xiàn)，因多種因素導(dǎo)致取樣存在各種阻力和無(wú)法實(shí)現(xiàn)不間斷檢測(cè)等的影響，導(dǎo)致無(wú)法充分達(dá)到針對(duì)性對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者指導(dǎo)用藥的目的，加之檢測(cè)持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和高額的監(jiān)測(cè)費(fèi)用，導(dǎo)致其在實(shí)際的臨床應(yīng)用中遇到了重重困難［6］。只有克服以上困難，建立起一個(gè)既高效迅速又經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的新的診斷手段，才能達(dá)到個(gè)性化指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌患者用藥的目的，其臨床價(jià)值也是非常巨大的［7］。第三代測(cè)序技術(shù) Ion Torrent，不但能夠通過(guò)單個(gè)平臺(tái)全面研究腫瘤基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳的改變以及單從基因組維度上亦可同時(shí)檢測(cè)點(diǎn)突變、拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異等所有DNA變異類型的能力，而且它加快了測(cè)序速度，同時(shí)優(yōu)化了數(shù)據(jù)分析過(guò)程［8］。即使是面對(duì)需要從頭到尾進(jìn)行測(cè)試數(shù)百堿基片段，也能達(dá)到99.9%以上的測(cè)序準(zhǔn)確度［9］。其摒棄了第一二代測(cè)序技術(shù)中采用生物發(fā)光檢測(cè)延伸產(chǎn)生的焦磷酸的檢測(cè)原理，通過(guò)檢測(cè)DNA鏈延伸時(shí)產(chǎn)生的氫離子實(shí)現(xiàn)邊合成邊測(cè)序，通過(guò)微乳液PCR制備測(cè)序模板，然后將制備得到的微球模板罝于一種半導(dǎo)體芯片上，加入含有DNA聚合酶的測(cè)序反應(yīng)液，并循環(huán)加入4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)，通過(guò)高靈敏的pH敏感電極測(cè)定與模板互補(bǔ)的dNTP被摻入時(shí)釋放的H2，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)模板序列的測(cè)定［10］。

本研究所研究的非小細(xì)胞肺癌藥物靶向基因?yàn)镋GFR和K－ras。EGFR是一種跨膜受體，在大部分的NSCLC患者身上都能夠檢測(cè)到EGFR。其中最為最常見(jiàn)的EGFR突變?yōu)橥怙@子E19del和外顯21L858R突變，能夠在接近50%的患者身上監(jiān)測(cè)到，其誘發(fā)的酪氨酸激酶活化，是靶向治療藥物厄洛替尼、吉非替尼治療活性的指標(biāo)之一［11］。K－ras是一種 GTP結(jié)合蛋白，研究發(fā)現(xiàn)K－ras基因突變現(xiàn)出現(xiàn)在消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者的血液中，這一檢測(cè)的應(yīng)用有助于腫瘤及早被診斷出來(lái)，并為預(yù)后判斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)提供重要參考依據(jù)。目前腫瘤特征性靶基因已經(jīng)在循環(huán)血中被檢測(cè)出來(lái)，從而使以前腫瘤基因檢測(cè)只能從腫瘤組織著手的問(wèn)題得到改變。研究稱20%的非小細(xì)胞肺癌存在K－ras突變，而肺腺癌更是占到了40%左右。K－ras突變狀態(tài)還能夠作為生存的預(yù)后指標(biāo)。研究提示［12］出現(xiàn)K－ras基因突變的非小細(xì)胞肺癌患者其生存時(shí)間顯著短于K－ras野生型者。同時(shí)基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)展也及其迅速，以Ion Torrent、Illumina Mi－ seq和Pac－Bio為代表的基于單分子測(cè)序的第三代測(cè)序儀能夠全面高效研究腫瘤基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳的改變，還能夠檢測(cè)出點(diǎn)突變、拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異等所有DNA變異類型的能力，較以往的測(cè)序儀，相同時(shí)間內(nèi)測(cè)量通量已經(jīng)提高了100倍，表現(xiàn)出高效，經(jīng)濟(jì)，簡(jiǎn)便等特性，具有臨床推廣應(yīng)用的巨大潛力。本研究觀察組采用Ion Torrent測(cè)序法測(cè)定術(shù)前術(shù)后復(fù)發(fā)患者EGFR和K－ras情況，發(fā)現(xiàn)使用Ion Torrent測(cè)序法測(cè)定術(shù)前及術(shù)后復(fù)發(fā)患者EGFR陽(yáng)性和K－ras突變陽(yáng)性的檢出率均顯著高于使用第一、二代測(cè)序法者。Ion Torrent測(cè)序技術(shù)借助了半導(dǎo)體芯片技術(shù)，和激光測(cè)序不同的是，它是建立在化學(xué)和數(shù)字信息基礎(chǔ)之上的一種新型技術(shù)。通過(guò)大規(guī)模并行半導(dǎo)體感應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA離子流的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。由于Ion Torrent半導(dǎo)體芯片上的反應(yīng)孔能夠高速有效的將遺傳信息翻譯成數(shù)碼的DNA測(cè)序結(jié)果，從而得到大量精確的測(cè)序數(shù)據(jù)。故通過(guò)本組研究我們認(rèn)為:對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者使用Ion Torrent測(cè)序技術(shù)測(cè)定外周血DNA，能更準(zhǔn)確的確定患者基因類型，從而為分子靶向治療提供依據(jù)。

表2 術(shù)后復(fù)發(fā)患者Ion Torrent測(cè)序EGFR和K-ras結(jié)果比較 n(%)

圖1 兩組測(cè)序EGFR陽(yáng)性1年生存情況比較

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