鄭介柏， 劉旭良， 陳文雄， 方雄明， 劉貽運

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第十二人民醫(yī)院， 廣東 廣州 510620)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis OP)是以骨質(zhì)量的丟失以及骨組織的退變?yōu)樘卣鞯墓谴x疾病。常導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性病理骨折，致殘率較高，已成為繼高血壓、糖尿病后的重大老年疾?。?］。目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病病因及愈后恢復(fù)與骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的增殖和分化密切相關(guān)［2］。Notch 通路是調(diào)節(jié)BMSC向成骨細胞的增殖與分化的關(guān)鍵通路之一［3，4］。據(jù)報道，激活 Notch通路可促進 BMSCs的增殖，但會抑制Notch通路可促進BMSCs成骨分化。DAPT作為Notch信號通路的阻斷劑，能夠特異地阻斷γ分泌酶的作用，從而阻止Notch信號通路的活化［5］。本實驗擬通過應(yīng)用Notch信號通路抑制劑DAPT，觀察阻斷Notch通路對于抑制SD大鼠BMSC增殖及誘導(dǎo)其定向成骨分化的作用。希望能為治療骨質(zhì)疏松性骨折提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物:雌性SD大鼠24只，12周齡，體重

250±30g(由廣州醫(yī)科大學(xué)大學(xué)城校區(qū)，動物實驗中心提供)，動物級別SPF級。

1.1.2 試劑和儀器:雙能X線吸收骨密度儀(DXA)，倒置顯微鏡，12孔培養(yǎng)板，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠);二氧化碳恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱(Thermoforma，美國);離心機(Optima XPN，美國)1%戊巴比妥鈉，75%乙醇，DMEM溶液，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基，胎牛血清(賽泰諾，美國)，0.25%胰蛋白酶，10%胎牛血清，地塞米松，維生素C，β－甘油磷酸鈉，DAPT美國Calbiochem公司。

1.2 方 法

1.2.1 模型建立:1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉;大鼠取俯臥位，腹正中切口，在輸卵管與子宮角交界處結(jié)扎，摘除卵巢，其中，陰性對照組(假手術(shù)組)僅在卵巢周圍切除少許脂肪組織，余手術(shù)操作同上;手術(shù)完畢后，清點手術(shù)器械，縫合關(guān)閉傷口;肌肉注射青霉素鈉20萬單位，預(yù)防感染。(n=6)。

1.2.2 骨密度測量:術(shù)后12周，進行雙能X線吸收骨密度儀(DXA)測量股骨、腰椎骨密度。

1.2.3 大鼠的BMSC分離培養(yǎng)及鑒定:造模成功后第12周，以頸椎脫臼法處死大鼠，處死的大鼠浸入75%乙醇10min，在SPF實驗室中，無菌手術(shù)操作臺上分離取出雙側(cè)股骨和脛骨，切除長骨兩端關(guān)節(jié)面及干骺端，顯露骨髓腔;吹打、抽吸將骨髓間充質(zhì)干細胞收集于離心管中，離心;利用DMEM重懸，之后按1∶1比例加入1.073g/mL Percoll液分離，吹打重懸，將細胞懸液，接種于 10cm培養(yǎng)皿中;之后，置入 37℃、5%CO2、100%飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后，首次換液，以后每3天換液1次，細胞80% －90%融合后用0.25%胰蛋白酶消化，傳代。

1.2.4 誘導(dǎo)分化培養(yǎng):將第2代細胞換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入1×108moL/L地塞米松、50mg/L維生素 C、1×108moL/L β－甘油磷酸鈉)培養(yǎng)，進行誘導(dǎo)分化。倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況、形態(tài)特性。第2代傳代培養(yǎng)的細胞用誘導(dǎo)培養(yǎng)液以1×106/mL的細胞密度接種于培養(yǎng)瓶中進行連續(xù)培養(yǎng)，每2－3d換液。共誘導(dǎo)培養(yǎng)3周。

1.2.5 DAPT溶液:完全溶于 DMSO，用 DMEM 培養(yǎng)液稀釋至1.00μmoL/L，DMSO 終濃度不超過0.1%。

1.2.6 實驗分組:DAPT治療組:培養(yǎng)液中含有濃度為1μmoL/L 的 DAPT，藥物濃度參考［6］。對照組:含等量DMSO的PBS注射液。

1.2.7 DAPT對MSC增殖的影響:MTT檢測各組BMSC的增殖:12孔培養(yǎng)板接種細胞，分別于誘導(dǎo)3、5、7、9、11d，分組換液，每組6復(fù)孔，每3－4d換液。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，取6孔平均值，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值(OD)為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。

1.2.8 DAPT對BMSC成骨分化的影響:堿性磷酸酶(alkaline phosphatase;ALP)定量測定:12孔培養(yǎng)板接種細胞，分別于誘導(dǎo) 3d、5d、7d、9d、11d 各組取 6 孔，各取上清100uL，按照試劑盒說明書進行操作，記錄結(jié)果，取6孔平均值(金氏單位U/100mL)，計算ALP活性。

2 結(jié)果

2.1 骨密度測量結(jié)果:與對照組比較，模型組大鼠腰椎及股骨骨密度下降明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。鋪滿瓶底，細胞為單層分布，第2代細胞，可見其集落樣生長(如圖1B)。

2.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng):將BMSC第2次傳代后，加入誘導(dǎo)液進行培養(yǎng)，第3－4d可觀察到細胞呈現(xiàn)梭型和多角形，其中胞體較普通的常規(guī)培養(yǎng)要大，到第7－8天可觀察到細胞突起多，細胞核較大，有些已經(jīng)形成細胞小結(jié)，具有了成骨細胞的形態(tài)特征(圖1C)。

2.3 生長曲線(MTT方法):第2次傳代后1－3d的細胞生長較慢，從第5天開始細胞增殖明顯加快，數(shù)量增加，對照組及DAPT組BMSC到第9天增殖達到最高峰(0.541 ±0.051;0.369 ±0.043)，而后回落。自第3天開始，兩組之間的OD值有統(tǒng)計學(xué)差異(n=6，P＜0.05)(圖2)

表1模型組及對照組的DXA測定結(jié)果(n=6，±s)

表1模型組及對照組的DXA測定結(jié)果(n=6，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01

指標(biāo) 模型組 對照組腰椎 BMD(g/cm2) 0.217 ±0.041*0.284 ±0.032股骨 BMD(g/cm2) 0.169 ±0.021*0.223 ±0.027

2.2 BMSC體外培養(yǎng)的形態(tài)觀察，見圖1。

圖1 BMSC體外培養(yǎng)形態(tài)觀察結(jié)果

2.2.1 原代培養(yǎng):BMSC原代細胞的特點是:均勻散布于培養(yǎng)瓶底，細胞呈現(xiàn)圓形，其中胞體較透亮、細胞核圓，與髓腔內(nèi)的其它雜細胞如白細胞等共同存在。經(jīng)定期換液后，去除其中大部分的懸浮細胞，可得到純化BMSC(如圖1A)。第7－8天時，BMSC相互接觸可

圖2 兩組BMSC增殖的對比

2.4 DAPT對BMSC成骨分化的檢測，ALP定量測定結(jié)果:ALP定量測定結(jié)果見圖3，對照組與DAPT組ALP表達均在第7 天達到峰值(0.831 ±0.047;1.236±0.059)，第7天前兩組之間ALP表達無明顯差異(P＞0.05)，兩組之間在第 7 天(t= －5.369)，第 9 天(t= －4.676)、第11 天(t= －3.389)ALP 表達具有統(tǒng)計學(xué)差異(n=6，P＜0.01)(圖3)。

圖3 兩組ALP定量分析

3 討論

隨著我國逐漸步入老齡社會，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是老年人，尤其是絕經(jīng)后老年婦女的一種常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重地威脅著老年人的身體健康。隨著我國人口的不斷老齡化和平均期望壽命增長，骨質(zhì)疏松癥將成為嚴(yán)重危害中老年人群身心健康和生活質(zhì)量的疾病之一，隨之而來的骨質(zhì)疏松性骨折也給社會及家庭帶來沉重的負擔(dān)［7，8］。骨質(zhì)疏松的發(fā)生與破骨細胞和成骨細胞的代謝失衡密切相關(guān)［9］，其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松屬于骨質(zhì)疏松的一種，絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素的逐漸缺乏，而后者的減少導(dǎo)致了破骨細胞造成的骨吸收大于成骨細胞的骨形成。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥由于自身的特點:全身性骨量普遍減少、骨的微結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性變，骨的脆性增高及骨折危險性增加［10，11］。本實驗通過去除大鼠卵巢成功制作了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠動物模型，并通過了骨密度檢測的驗證。

在已發(fā)現(xiàn)的少數(shù)信號通路中，有少數(shù)的信號通路是用來調(diào)節(jié)細胞的命運的，如細胞的增殖分化與死亡。Notch通路就是其中的一種。根據(jù)國內(nèi)外的相關(guān)報道，Notch通路是調(diào)控BMSC向成骨細胞的增殖和定向分化的關(guān)鍵通路之一［12］。Notch基因發(fā)現(xiàn)于一個世紀(jì)前，Notch的配體常常以跨膜蛋白的形式存在，當(dāng)Notch受體與配體結(jié)合后，活化的Notch受體從胞膜脫落下來后，可直接轉(zhuǎn)至核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子結(jié)合而激活靶基因，這種傳導(dǎo)非常的簡單，并且不需要第二信使的傳導(dǎo);激活Notch可引發(fā)多種信號，多種調(diào)節(jié)因素通過不同機制調(diào)節(jié)Notch信號。因為Notch信號通路的這種簡單的跨膜傳遞信號途徑，具有了特異性強的優(yōu)勢，基本避免其他信號的干擾。Notch經(jīng)過兩步蛋白酶水解過程，釋放出Notch的胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域NICD，其中介導(dǎo)這酶切過程的關(guān)鍵蛋白酶之一為γ分泌酶。據(jù)報道，Notch通路對于MSC細胞的成骨分化十分重要，有人發(fā)現(xiàn)在Prxl增強子控制下的Notch的過表達會誘導(dǎo)間充質(zhì)前體細胞的增殖，抑制其分化。那么通過抑制Notch通路的激活是否能達到促進BMSC向成骨細胞的分化呢?

DAPT作為Notch信號通路的阻斷劑，能夠特異地阻斷γ分泌酶的作用，從而抑制Notch信號通路的活化。本實驗通過DAPT的應(yīng)用，阻斷了Notch通路。通過MTT法檢測細胞增殖活力，MTT法是檢測細胞增殖活力的一種簡便、準(zhǔn)確的方法，其中活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中是MTT比色法的原理與關(guān)鍵，通過比色，對A值進行分析，可反映細胞生長和存活情況。在實驗中我們觀察到與對照組相比，DAPT阻斷Notch通路后，BMSC的增殖受到了抑制。這與目前的相關(guān)研究結(jié)果是一致的，但其整體的生長曲線與對照組相似，這也說明了在調(diào)控BMSC增殖的過程中應(yīng)該涉及到多條信號通路的共同作用。

在骨的發(fā)生、發(fā)育和修復(fù)與成骨細胞密切相關(guān)，因此成骨細胞也成為骨組織工程的關(guān)鍵細胞。ALP活性是成骨細胞分化的早期指標(biāo)，在體外鈣化中起關(guān)鍵性作用，反映了細胞的成骨活性。本研究發(fā)現(xiàn)在抑制Notch通路活化后，ALP活性實驗組明顯高于對照組，BMSC向成骨細胞的定向分化是增強的。

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