石 淼,李艷軍,劉永昌,張新宇,薛 飛*,孫 杰

(1 石河子大學 生命科學學院,新疆石河子 832003;2 石河子大學 農學院/新疆兵團綠洲生態(tài)農業(yè)重點實驗室,新疆石河子 832003)

棉花纖維發(fā)育相關基因GhPRP10的克隆及其功能分析

石 淼1,李艷軍2,劉永昌2,張新宇2,薛 飛2*,孫 杰2

(1 石河子大學 生命科學學院,新疆石河子 832003;2 石河子大學 農學院/新疆兵團綠洲生態(tài)農業(yè)重點實驗室,新疆石河子 832003)

利用電子序列拼接結合RT-PCR技術,從12DPA(開花后天數)棉纖維中克隆到1個編碼富含脯氨酸蛋白(PRPs)基因,命名為GhPRP10(登錄號KP036633)。GhPRP10基因開放閱讀框為684 bp,編碼228個氨基酸,其中脯氨酸(Pro)含量為34.6%。序列分析發(fā)現GhPRP10蛋白具有N端信號肽和富含脯氨酸區(qū)域,屬于第一類PRPs。實時熒光定量PCR(RT-PCR)結果顯示,GhPRP10在棉纖維組織中優(yōu)勢表達,在纖維發(fā)育過程中的表達量呈現先升高后降低的趨勢,在18DPA纖維中表達量最高。利用Gateway技術構建植物過量表達載體,轉入煙草BY-2懸浮細胞,表型觀察和細胞長度測量結果顯示,轉GhPRP10基因細胞比野生型細胞顯著增長。根據該基因的組織表達特征和轉基因細胞表型分析,推測GhPRP10基因在纖維伸長和次生壁合成過程中發(fā)揮作用。

棉花;纖維;富含脯氨酸蛋白;BY-2煙草懸浮細胞

棉花是世界上最重要的經濟作物之一,中國是世界上最大的棉花生產和消費國。棉纖維是棉花的主產品,其品質優(yōu)劣直接決定紡織品的質量和效益。棉纖維是由胚珠表皮細胞發(fā)育而成的單細胞,其伸長率和最終長度遠超過其它植物細胞,是研究植物細胞伸長和細胞壁生物合成的理想模型[1]?？寺∶蘩w維發(fā)育相關基因并解析其發(fā)育的分子調控機制,對改良棉纖維品質具有十分重要的理論意義[2]。

細胞壁是植物細胞特有的結構,它可以保護細胞并決定細胞的大小和形狀,對細胞的生長發(fā)育具有重要作用[3]。植物細胞壁中除含有多糖外,還含有大量的蛋白成分。細胞壁結構蛋白主要分為4類[4]:富含脯氨酸蛋白(proline-rich Proteins,PRPs)、富含甘氨酸蛋白(glycine-rich proteins,GRPs)、伸展蛋白和阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins,AGPs)。PRPs是一類富含脯氨酸和羥脯氨酸的細胞壁結構蛋白,在植物中廣泛存在,前人已從大豆、小麥、玉米、水稻等植物中分離到多個編碼該蛋白的基因[5-8],這些基因在逆境脅迫[9-12]和激素[13-14]響應的過程中發(fā)揮重要作用。此外,PRPs不僅能夠決定細胞形態(tài),而且能夠調控植物的生長發(fā)育,AtPRP3[15]主要在擬南芥的根毛基部和正在伸長的根尖中表達,該基因突變后導致根毛形態(tài)異常、分枝發(fā)生變化,突變體植株的根毛顯著減少,表明該基因參與根毛的形態(tài)建成。AtPRP4[16]在擬南芥的葉、莖、花、長角果和根形成的早期階段表達,該基因突變體植株的側根減少,葉片變小,種子生長受到抑制。AtPRPL1[17]僅在擬南芥的根和毛狀體細胞中表達,將AtPRPL1基因敲除后使擬南芥根毛明顯變短,該基因過量表達后能夠促進根毛的伸長。

目前人們已從棉纖維細胞中分離出多個優(yōu)勢或特異表達的PRPs基因[18-22],例如GhPRP1、GhPRP2、GhPRP3、GhPRP5等基因。過量表達GhPRP5的轉基因擬南芥生長遲緩,葉表皮細胞變小,植株矮小[23]。雖然該類基因在棉纖維中大量存在,但功能研究仍較少,因此研究這類蛋白在纖維發(fā)育過程中的功能對明確纖維發(fā)育機制至關重要。本研究從棉纖維中克隆到1個新的PRP基因,命名為GhPRP10,通過實時熒光定量PCR分析該基因在棉花不同組織中的表達情況,構建植物過量表達載體轉化野生煙草BY-2懸浮細胞,對轉基因煙草懸浮細胞的表型變化進行觀察,為進一步闡明該基因在棉纖維細胞發(fā)育過程中的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

棉花(GossypiumhirsutumL.)品種‘新陸早33號’由石河子大學棉花研究所提供。將該材料播種于石河子大學農學院試驗田,按常規(guī)進行農事作業(yè)和田間管理,在盛花期掛牌標記棉鈴,按3、6、9、12、15、18、21、24、27 DPA(開花后天數)采集棉鈴,室內剝取纖維,液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。

室內取‘新陸早33號’種子剝去種皮,將種仁浸泡于0.1% HgCl2溶液中消毒10 min,用無菌水反復沖洗3～5次,播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基,28 ℃暗培養(yǎng)4 d,然后進行水培。待長出真葉后,取其根、莖、真葉,花在田間植株上采集,上述材料液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱,用于總RNA提取。

野生型煙草(Nicotianatabacum)BY-2懸浮細胞用LS固體培養(yǎng)基每15 d繼代1次進行保存。

1.2 方 法

1.2.1 棉花總RNA提取和第一鏈cDNA合成 棉花根、莖、葉、花和不同發(fā)育時期纖維的總RNA提取采用改良CTAB法[24],使用Reverse Transcriptase M-MLV反轉錄酶和引物Oligo dT(T18)將RNA反轉錄合成cDNA,具體步驟按照說明書進行。

1.2.2GhPRP10基因克隆 以棉花PRP相關EST序列BQ410667為探針序列,使用NCBI BLASTn對棉花EST序列進行比對,對同源性高的EST序列利用DNASTAR軟件進行序列拼接,得到一個新的PRP相關基因序列,長度為864 bp。通過ORF finder預測其開放閱讀框(ORF),設計擴增該ORF特異性引物ORF1-F和ORF1-R(表1),以12DPA棉纖維cDNA為模板,使用Primer STAR高保真酶進行PCR擴增,程序為98 ℃預變性3 min;98 ℃變性10 s,54 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán),72 ℃延伸10 min。擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,回收PCR產物連接到載體pGEM-T easy上,熱激轉化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞,挑取陽性克隆經過PCR和酶切雙重驗證,將質粒送至北京六合華大基因有限公司進行測序。

表1 PCR擴增引物

1.2.3 生物信息學分析 使用在線軟件InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)進行蛋白質一級結構分析,預測GhPRP10的跨膜信號肽。用DNAMAN和Clustal X進行多重序列比對及同源性比對,采用MEGA6軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR 根據GhPRP10基因的cDNA序列設計引物PRPS-F和PRPS-R(表1),分別以棉花根、莖、葉、花和不同時期棉纖維為模板進行實時熒光定量PCR擴增,反應過程在羅氏Light Cycler 480儀器上進行。內參基因為UBI(GenBank序列號為AY117057),根據其序列設計引物UBI-F和UBI-R(表1),產物大小為210 bp。反應體系(10 μL)包含上、下游引物各0.2 μL,SYBR Premix ExTaq5 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 3.6 μL。實時熒光定量PCR反應參數:94 ℃預變性1 min,94 ℃變性15 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán)。實驗設3次重復,結果按照2-△Ct法處理數據,并制作柱狀圖顯示該基因在棉花不同組織中的表達情況。

1.2.5 植物過量表達載體構建及煙草BY-2懸浮細胞的轉化 利用Gateway同源重組原理[25]構建GhPRP10植物過量表達載體pGWB17-GhPRP10,構建過程按照Invitrogen公司的pENTRTMDirectional TOPO?Cloning Kits和Gateway?LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix試劑盒進行。采用農桿菌電擊轉化法將質粒轉入農桿菌LBA4404的菌株中。根據吳科瀛的方法將植物過表達載體轉化煙草BY-2懸浮細胞[26],獲得轉基因抗性細胞團。挑取長勢良好的抗性細胞團繼代到新鮮篩選培養(yǎng)基中,每15 d繼代1次,去除嵌合的野生細胞,繼代4次后得到黃色純合體轉基因系。使用Trizol試劑盒提取總RNA以ORF1-F和ORF1-R為引物進行RT-PCR驗證。取適量轉基因細胞用含有抗生素的LS液體培養(yǎng)基搖培3～4 d后,用熒光素(FDA)進行染色后在熒光顯微鏡下連續(xù)6 d進行細胞形態(tài)觀察拍照。使用Image J軟件對野生型和3個轉基因系細胞中分別選取的40個細胞的長度進行測量,數據統(tǒng)計分析使用SPSS 17.0軟件。

2 結果與分析

2.1 GhPRP10基因克隆與序列分析

以12DPA棉纖維細胞cDNA為模板,利用引物ORF1-F和ORF1-R進行RT-PCR擴增拼接后的PRP基因ORF,獲得該基因序列大小為687 bp(圖1),將擴增序列與拼接序列進行比對,一致性達到100%。序列分析發(fā)現該基因共編碼228個氨基酸,其中脯氨酸占34.6%,蘇氨酸占13.2%,絲氨酸占13.2%,分子量為22 209.5 kD,等電點9.75。蛋白結構域分析發(fā)現(圖2),該基因編碼的蛋白屬于第一類PRPs,第1～23個氨基酸殘基為信號肽區(qū)域,有一個富含脯氨酸重復基序的區(qū)域,該區(qū)域含有15個分散的A(or S)T(or S)PPP基序,7個XPP基序和2個無規(guī)律的基序TQPPP和TSPPP,將該基因命名為GhPRP10。

圖1 GhPRP10基因PCR擴增電泳結果M.Marker Ⅲ;1.陰性對照;2～6.PCR擴增產物

圖2 GhPRP10基因的cDNA及氨基酸序列方框部分表示N端信號肽;雙下劃線表示A(S)T(S)PPP基序;虛線表示TQPPP和TSPPP;粗下劃線表示XPP基序;星號表示終止密碼子

2.2 GhPRP10系統(tǒng)進化分析

利用Clustal X2.1將GhPRP10氨基酸序列與其它植物中PRPs氨基酸序列進行同源比對(圖3),圖中顯示GhPRP10與陸地棉GhPRP(AAA79360),亞洲棉Cotton_A_20973、Cotton_A_21704,雷蒙德氏棉Gorai_013G048900、Gorai_005G233500,海島棉GbPRP(AAA79364),可可樹TcUP(EOX98411)的一致性均較高。為進一步明確該蛋白與其它植物中富含脯氨酸蛋白之間的進化關系,在GenBank中選取已登錄的不同植物的富含脯氨酸蛋白構建進化樹(圖4),結果顯示GhPRP10是雷蒙德氏棉Go-rai013G048900、亞洲棉Cotton_A_20973基因的同源基因,GhPRP10與陸地棉GhPRP(AAA79360)親緣關系較近,與其他PRPs基因的遺傳距離相對較遠。

圖3 植物中不同PRPs蛋白的氨基酸序列比對

圖4 棉花中GhPRP10與其它植物中PRPs的進化樹分析圖中分支點的數字表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復該節(jié)點可信度的百分比;標尺代表遺傳距離;三角符號代表GhPRP10

2.3 GhPRP10基因的表達分析

利用Real time PCR技術分析GhPRP10基因在棉花不同組織中的表達情況,結果表明該基因在棉花根、葉和花中幾乎不表達,在莖中微弱表達;在棉纖維中呈現優(yōu)勢表達,且受棉纖維發(fā)育調控,即在3～9DPA纖維細胞中幾乎不表達,12～18DPA表達量持續(xù)增高,在18DPA達到最高,21～27DPA表達量有所降低,但仍維持較高的表達水平(圖5)。由上述結果推測GhPRP10在棉纖維伸長及次生壁合成階段發(fā)揮作用。

圖5 GhPRP10在棉花不同組織中的表達情況R.根;S.莖;L.葉;F.花;3～27分別為3～27 DPA棉纖維細胞

2.4 轉基因BY-2細胞的表型分析

將GhPRP10基因構建到植物表達載體上轉化煙草BY-2細胞。RT-PCR結果顯示8個BY-2細胞轉基因系均擴增出約687 bp條帶(圖6),表明GhPRP10基因已經成功轉入煙草BY-2細胞中。將搖培好的野生型細胞和轉基因細胞分別進行染色后在熒光顯微鏡下連續(xù)觀察6 d,發(fā)現野生型細胞在6 d中均表現為不規(guī)則圓形,細胞團由小迅速增大,增殖速度快(圖7,W1～W6);而轉基因細胞在6 d中均呈現不規(guī)則長形,分布較松散,細胞團增殖速度慢(圖7,T1～T6)。對野生型和3個轉基因細胞系的細胞長度進行測量,結果顯示3個轉基因細胞系(n=40)的平均細胞長度均顯著長于野生型細胞,為野生型細胞的2倍以上(圖8)。表明該基因的表達能夠促進細胞伸長,推測其在棉纖維細胞伸長方面發(fā)揮作用。

圖6 轉基因BY-2細胞的RT-PCR驗證M.Marker Ⅲ;1～8.8個轉基因BY-2細胞系;9.野生型細胞;10.陽性對照

圖7 野生型和轉基因BY-2細胞熒光顯微圖W1～W6.1～6 d野生型細胞的觀察圖;T1～T6.1～6 d轉基因細胞觀察圖

圖8 野生型和轉基因BY-2細胞長度比較WT.野生型細胞;1～3.轉基因細胞系;標注字母表示0.05水平顯著性

3 討 論

PRPs是植物細胞壁結構蛋白[27],按結構可分為3類[11]:第一類由N端信號肽和富含脯氨酸重復基序區(qū)構成;第二類由N端信號肽、富含脯氨酸重復基序區(qū)和C端含有半胱氨酸區(qū)構成;第三類由N端親水結構域和脯氨酸重復基序區(qū)構成。本研究從棉纖維中克隆了1個新的PRPs基因GhPRP10,蛋白質一級結構分析發(fā)現GhPRP10蛋白屬于第一類PRPs,含有N端信號肽,該結構域可能起著將蛋白質錨定到細胞壁上的作用。進化樹分析發(fā)現GhPRP10與其他已命名的陸地棉PRPs基因遺傳距離相對較遠,表明該基因是一個新的PRP基因。同源性分析發(fā)現GhPRP10在陸地棉供體祖先種雷蒙德氏棉、亞洲棉中的同源基因分別是Gorai013G-048900和Cotton_A_20973,說明GhPRP10在陸地棉中存在多個拷貝。

棉纖維發(fā)育分為4個時期,即起始期(0～5DPA)、伸長期(5～20DPA)、次生壁合成期(20～45DPA)和成熟期(45～50DPA)[28]。前人已在棉纖維中發(fā)現多個PRP基因[18-22],其中GhPRP3、GhPRP5在棉纖維細胞中特異表達,在伸長期表達量較高,且受纖維發(fā)育調控[19-20]。本研究中實時熒光定量PCR分析表明GhPRP10基因在棉花纖維中優(yōu)勢表達,其表達量呈先上升,至18DPA達到最高峰,之后降低的趨勢,但在21～27DPA表達量仍維持在較高水平。GhPRP10高表達時期處于棉纖維細胞伸長與次生壁合成期,推測GhPRP10不僅參與棉纖維伸長,且在次生壁的建成過程中發(fā)揮重要作用。

已有研究表明,富含脯氨酸蛋白涉及細胞的生長發(fā)育以及應對外界環(huán)境刺激等多種功能[3-4]。煙草NtProRP1是一個滲透脅迫響應因子,對花粉管伸長及在種胚發(fā)育的早期有重要作用[29]。HyPRP1在辣椒和煙草中對細胞壞死具有正調控作用,對病原菌的防御具有負調控作用[30]。關于棉花PRPs基因的功能研究很少,近期許文亮等發(fā)現在棉花中干擾GhPRP5表達后能使棉纖維變長,說明該基因在棉纖維發(fā)育過程中為負調控因子。同時,GhPRP5還參與調控擬南芥脅迫相關基因的表達[23]。本研究通過將GhPRP10基因轉化煙草BY-2細胞,發(fā)現該基因過量表達使BY-2細胞長度顯著增長,且細胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的改變,由圓形細胞變?yōu)殚L形細胞,這與該基因在棉纖維的伸長期和次生壁增厚期優(yōu)勢表達相一致。綜上分析,GhPRP10基因能夠促進細胞伸長,推測它能調控棉纖維的發(fā)育。Tábata等[31]發(fā)現快速堿化多肽因子AtRALF1通過調控AtPRP1、AtPRP3(富含脯氨酸的蛋白)、AtHRPG2(富含羥脯氨酸的糖蛋白),以及TCH4(木葡聚糖)來阻止油菜素類固醇的合成,從而影響根細胞的伸長和側根的形成。GhPRP10能夠促進煙草懸浮細胞的伸長,但如何調控棉纖維細胞的發(fā)育還有待進一步研究。

[1] KIM H J,TRIPLETT B A.Cotton fiber growth in plant andinvitro:models for plant cell elongation and cell wall biogenesis[J].PlantPhysiology,2001,127(4):1 361-1 366.

[2] GUO W ZH(郭旺珍),SUN J(孫 敬),ZHANG T ZH(張?zhí)煺?.Cloning and molecular breeding of the fiber quality gene[J].ChineseScienceBulletin(科學通報).2003,48(5):410-417(in Chinese).

[3] KEEGSTRA K.Plant cell walls[J].PlantPhysiology,2010,154(2):483-486.

[4] SHOWALTER A M.Structure and function of plant cell wall proteins[J].ThePlantCell,1993,5(1):9-23.

[5] ZHAI Y(翟 瑩),LEI T T(雷婷婷),LI J W(李景文),etal.Cloning and expression of a stress-inducedGmPRPgene in soybean (Glycinemax)[J].ActaAgronomicaSinica(作物學報),2011,37(12):2 152-2 157(in Chinese).

[6] 趙維萍.普通小麥中一類富含脯氨酸蛋白基因的克隆與功能分析[D].南京:南京農業(yè)大學,2011.

[7] VIGNOLS F,JOSE-ESTANYOL M,CAPARROS-RUIZ D,etal.Involvement of a maize proline-rich protein in secondary cell wall formation as deduced from its specific mRNA localization[J].PlantMolecularBiology,1999,39(5):945-952.

[8] WANG R,CHONG K,WANG T.Divergence in spatial expression patterns and in response to stimuli of tandem-repeat paralogues encoding a novel class of proline-rich proteins inOryzasativa[J].JournalofExperimentalBotany,2006,57(11):2 887-2 897.

[9] PRIYANKA B,SEKHAR K,REDDY V D,etal.Expression of pigeonpea hybrid-proline-rich protein encoding gene (CcHyPRP) in yeast andArabidopsisaffords multiple abiotic stress tolerance[J].PlantBiotechnologyJournal,2010,8(1):76-87.

[10] YI Z,MICHAEL SCHLPPI.Cold responsiveEARLI1 typeHyPRPsimprove freezing survival of yeast cells and form higher order complexes in plants[J].Planta,2007,227(1):233-243.

[11] HE C Y,ZHANG J S,CHEN S Y.A soybean gene encoding a proline-rich protein is regulated by salicylic acid,an endogenous circadian rhythm and by various stresses[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2002,104(6-7):1 125-1 131.

[12] QIN L X,ZHANG D J,LI X B,etal.CottonGhHyPRP3 encoding a hybrid proline-rich protein is stress inducible and its overexpression inArabidopsisenhances germination under cold temperature and high salinity stress conditions[J].ActaPhysiologiaePlantarum,2013,35(5):1 531-1 542.

[13] ZHANG D J(張德靜),QIN L X(秦麗霞),LI L(李 龍),etal.Expression of cottonGhPRP5 gene inArabidopsisenhances susceptibility to ABA and salt stresses[J].ActaAgronomicaSinica(作物學報),2013,39(3):563-569(in Chinese).

[14] CHAI Q X(柴秋霞),LI B CH(李本昌),XU Z Q(徐子勤).Subcellular localization and resistance toGibberellafujikuroiof AtELHYPRP2 in transgenic tobacco[J].ChineseJournalofBiotechnology(生物工程學報),2014,30(3):472-484(in Chinese).

[15] BERNHARDT C,TIERNEY M L.Expression ofAtPRP3,a proline-rich structural cell wall protein fromArabidopsis,is regulated by cell-type-specific developmental pathways involved in root hair formation[J].PlantPhysiology,2000,122(3):705-714.

[16] RAAB S,HOTH S.A Mutation in theAtPRP4 splicing factor gene suppresses seed development inArabidopsis[J].PlantPhysiology,2007,9(3):447-452.

[17] BORON A K,VAN ORDEN J,NEKTARIOS MARKAKIS M,etal.Proline-rich protein-likePRPL1 controls elongation of root hairs inArabidopsisthaliana[J].JournalofExperimentalBotany,2014,65(18):5 485-5 495.

[18] JOHN M E,KELLER G.Characterization of mRNA for a proline-rich protein of cotton fiber[J].PlantPhysiology,1995,108(2):669-676.

[19] TAN H,CREECH R G,JENKINS J N,etal.Cloning and expression analysis of two cotton (GossypiumhirsutumL.) genes encoding cell wall proline-rich proteins[J].DNASequence,2001,12(5-6):367-380.

[20] XU W L(許文亮),HUANG G Q(黃耿青),LI X B(李學寶),etal.Molecular characterization and expression analysis of five novel genes encoding proline-rich proteins in cotton[J].ProgressinBiochemistryandBiophysics(生物化學與生物物理進展),2007,34(5):509-517(in Chinese).

[21] LI X B(李學寶),HUANG G Q(黃耿青),XU W L(許文亮),etal.Solation of the cotton genes that encoded cell wall proteins and their expression profile in cotton fibers[J].JournalofCentralChinaNormalUniversity(華中師范大學學報),2005,39(4):509-513(in Chinese).

[22] FENG J X,JI S J,SHI Y H,etal.Analysis of five differentially expressed gene families in fast elongating cotton fiber[J].ActaBiochimicaandBiophysica,2004,36(1):51-56.

[23] XU W L,ZHANG D J,LI X B,etal.Cotton PRP5 gene encoding a proline-rich protein is involved in fiber development[J].PlantMolecularBiology,2013,82:353-365.

[24] JIANG J X(蔣建雄),ZHANG T ZH(張?zhí)煺?.Extraction of total RNA in cotton tissues with CTAB-acidic phenolic method[J].CottonScience(棉花學報),2003,15(3):166-167(in Chinese).

[25] KARIMI M,INZé D,DEPICKER A.GATEWAY vectors for agrobacterium-mediated plant transformation[J].TrendsinPlantScience,2002,7(5):193-195.

[26] WU K Y(吳科瀛),LIANG Y L(梁玉玲).Study on tobacco BY-2 cell culture and salt stress[J].AnimalHusbandryandFeedScience(畜牧與飼料科學),2009,30(4):8-9(in Chinese).

[27] FRANCISCO S M,TIERNEY M L.Isolation and characterization of a proline-rich cell wall protein from soybean seedlings[J].PlantPhysiology,1990,94(4):1 897-1 902.

[28] DU X M(杜雄明),PAN J J(潘家駒),WANG R H(汪若海).Differentiation and development of fiber cells on the ovules in cotton[J].CottonScience(棉花學報),2000,12(4):212-217(in Chinese).

[29] CHEN J,ZHAO J,NING J,etal.NtProRP1,a novel proline-rich protein,is an osmotic stress-responsive factor and specifically functions in pollen tube growth and early embryogenesis inNicotianatabacum[J].PlantCellandEnvironment,2014,37(2):499-511.

[30] YEOM S I,SEO E,OH S K,etal.A common plant cell-wall proteinHyPRP1 has dual roles as a positive regulator of cell death and a negative regulator of basal defense against pathogens[J].ThePlantJournal,2012,69(5):755-768.

(編輯:宋亞珍)

Cloning and Functional Analysis ofGhPRP10 Relatedto Fiber Development inGossypiumhirsutum

SHI Miao1,LI Yanjun2,LIU Yongchang2,ZHANG Xinyu2,XUE Fei2*,SUN Jie2

(1 College of Life Science,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 College of Agronomy,Shihezi University/ Key Oasis Eco-agriculture Laboratory of Production and Construction Group,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

In this study,a new gene encoding proline-rich protein was isolated from 12 days post anthesis(DPA) cotton fiber,and designated asGhPRP10.The ORF of the gene was 684bp encoding 228 amino acids,contained 34.6% proline.The bioinformatics analysis showed that the protein encoded by this gene belonged to the first class of PRPs,which has a signal peptide in N terminal and a proline rich conserved region.The quantitative RT-PCR results showed thatGhPRP10 is preferentially expressed in cotton fiber.The transcript level increased along with fiber development and reached the highest abundance at 18DPA,after which time it gradually decreased.The plant over-expression vector was constructed using Gateway technology and then transformed into tobacco suspension BY-2 cells.The phenotype observation and cell length measurement found that the transgenic cells were significantly longer than that of the wild type.Based on the expression profile ofGhPRP10 and phenotype analysis of transgenic cells,it is presumed that the gene plays an important role in the process of fiber elongation and secondary wall synthesis.

cotton;fiber;proline-rich protein;tobacco suspension BY-2 cells

1000-4025(2015)04-0639-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0639

2014-11-26;修改稿收到日期:2015-03-05

國家自然科學基金(U1128301);十二五科技支撐計劃項目(2011BAD35B05);石河子大學育種專項(gxjs2012-yz01,gxjs2012-yz04)

石 淼(1989-),女,在讀碩士研究生,主要從事棉花分子育種研究。E-mail:shim0501@163.com

*通信作者:薛 飛,副教授,博士,主要從事棉花分子育種研究。E-mail:xuefei2011@gmail.com

Q785;Q786

A