范 茁, 吳振強(qiáng)(華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510006)

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大鼠心室肌細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究生實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

范 茁, 吳振強(qiáng)
(華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510006)

面向生物學(xué)科碩士研究生開設(shè)細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)可彌補(bǔ)高校細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)教學(xué)領(lǐng)域的空缺，使學(xué)生更好掌握細(xì)胞電生理理論知識(shí)。論文詳細(xì)闡述了依托于膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)、以大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位為主要研究對(duì)象的細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)課程的具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。記錄大鼠心室肌細(xì)胞的動(dòng)作電位、三種主要成分(Na+、K+和Ca2+)離子電流的分離可以使學(xué)生更好理解動(dòng)作電位產(chǎn)生的離子機(jī)制和三種主要成分電流的動(dòng)力學(xué)特性。此外，記錄和觀察BK單通道和全細(xì)胞電流特征可以使學(xué)生在認(rèn)識(shí)某種特異性離子通道電流特性的同時(shí)加深對(duì)膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)的理解和掌握。

細(xì)胞電生理； 膜片鉗； 動(dòng)作電位； 全細(xì)胞電流； 單通道電流

0 引 言

高校各學(xué)科的教學(xué)強(qiáng)調(diào)理論和實(shí)踐相結(jié)合，理論學(xué)習(xí)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)相輔相成、互相促進(jìn)從而提升教學(xué)的質(zhì)量和效益。眾所周知，實(shí)驗(yàn)?zāi)茯?yàn)證理論的正確性，能使抽象的理論知識(shí)更鮮明、易懂，能培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力，在高校各學(xué)科尤其是生物學(xué)科的教學(xué)體系中占有非常重要的地位[1-2]。然而，細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)課，因?yàn)槠浼夹g(shù)難度高等客觀原因一直是大多數(shù)高校生物教學(xué)領(lǐng)域的空白。本文將以大鼠心室肌細(xì)胞為主要研究對(duì)象，闡述本學(xué)校生物學(xué)院為研究生開設(shè)的細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)課程的具體內(nèi)容，包含課程涉及的具體的實(shí)驗(yàn)材料、方法、步驟以及對(duì)結(jié)果的分析。本課程涉及到的實(shí)驗(yàn)包括：大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位和動(dòng)作電流的觀測(cè)；形成心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的主要成分離子電流(Na+、K+、Ca2+)的觀測(cè)；轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞上大電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道(BK)單通道及全細(xì)胞電流的觀測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)的選擇依據(jù)

心肌細(xì)胞是除神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞外的另一大類重要的可興奮性細(xì)胞，心肌細(xì)胞電生理是心肌搏動(dòng)、泵血等生理功能的基礎(chǔ)，對(duì)其研究有助于理解心肌興奮收縮偶聯(lián)、心跳等組織和機(jī)體電生理現(xiàn)象[3-5]。大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程較長，鈣離子通道含量相對(duì)豐富，動(dòng)作電位有明顯的平臺(tái)期，這些特性使之有利于用來研究不同相期和離子電流成分的對(duì)應(yīng)關(guān)系[6-7]。此外，選擇大鼠心室肌細(xì)胞作為細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)課程主要研究對(duì)象是跟本實(shí)驗(yàn)室的科研方向相關(guān)的，我們有穩(wěn)定可靠的樣品來源能保障實(shí)驗(yàn)課的順利進(jìn)行。

本課程還包含對(duì)BK通道單通道及全細(xì)胞電流的觀測(cè)，是為了讓學(xué)生學(xué)習(xí)某種特異性的離子通道的電生理特性及其動(dòng)力學(xué)特征。采取單通道和全細(xì)胞兩種記錄方法可以讓學(xué)生掌握膜片鉗技術(shù)中兩種最普遍的記錄方式，為其以后從事此領(lǐng)域的研究打下基礎(chǔ)。BK是根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的離子通道質(zhì)粒選擇的，也可以選其他種類的離子通道。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 大鼠心肌細(xì)胞的急性分離

體重為250～300 g的大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，之后打開胸腔并迅速取下心臟，放入預(yù)冷的tyrode溶液中，輕輕擠壓心臟后迅速將其掛在langendorff灌流裝置上，無鈣tyrode液灌流4 min，之后用含0.05 mmol/L Ca2+、1 mg/mL II型膠原酶和0.1 mg/mL蛋白酶的tyrode液灌流消化1 min，再用含 0.2 mmol/L Ca2+、1 mg/mL II型膠原酶和0.1 mg/mL蛋白酶的tyrode液灌流15 min，心臟變軟后停止消化。將心臟取下，分離心室將其在含0.6 mmol/L Ca2+、1 mg/mL II型膠原酶和0.1 mg/mL蛋白酶的tyrode液中剪碎，37 ℃、50 r/min振蕩消化4 min。之后用250 μm網(wǎng)篩過濾，500 r/min離心45 s，加入適量含1 mmol/L Ca2+的tyrode液重力沉降6～8 min。棄上清，加入適量KB液于4 ℃保存[8-12]。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及BK通道的轉(zhuǎn)染

HEK293細(xì)胞隔天傳代，放置于含5% CO2的培養(yǎng)箱37 ℃恒溫培養(yǎng)，隔天用胰酶消化并傳代于底部鋪有碎玻璃片的35 mm塑料平皿中。待玻片上的細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，采用脂質(zhì)體(Lipo 2000，GIBCO)轉(zhuǎn)染法，將克隆有BK通道的質(zhì)粒pcDNA3.1-BK和綠色熒光蛋白GFP共轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞，24 h后選擇發(fā)綠色熒光的細(xì)胞用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

2.3 電生理記錄

膜片鉗記錄使用的是HEKA公司的EPC-10型號(hào)放大器(HEKA，德國)，實(shí)驗(yàn)在室溫(≈22 ℃)進(jìn)行。玻璃電極由Sutter公司的P97電極拉制儀(Sutter，美國)拉制而成，用于全細(xì)胞記錄的電極電阻為2～4 MΩ，用于單通道記錄的電極電阻為4～6 MΩ。全細(xì)胞記錄的采樣頻率為2 kHz，單通道記錄的采樣頻率為10 kHz。心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位由900 pA、5 ms的脈沖電流誘發(fā)，動(dòng)作電流則反過來以測(cè)得的動(dòng)作電位為刺激電壓程序。心室肌細(xì)胞三種成分離子電流(Na+、K+和Ca2+)的分離，則通過阻斷劑和不同的電壓脈沖程序?qū)崿F(xiàn)。Na+電流通過1 uM TTX和時(shí)長為1 s的-40 mV鉗制電壓阻斷失活，K+電流通過TEA+和Cs+阻斷，Ca2+通道通過10 μmol/L nifedipine阻斷[13-15]。三種離子電流記錄的電壓脈沖程序分別為：Na+，-90～-10 mV;K+,-90～+30 mV;Ca2+,-40～+60 mV;三種離子混合電流，-90～+30 mV。

2.4 溶液和試劑

實(shí)驗(yàn)中用到的所有配置細(xì)胞內(nèi)外液的試劑和藥品均購自Sigma公司(Sigma Aldrich，美國)，各溶液配方如下。

Tyrode液(in mmol/L)：120 NaCl，5.4 KCl，25 HEPES，5 MgCl2，0.33 NaH2PO4，22 Glucose，10 Taurine(pH 7.2～7.4)。

KB液(in mmol/L):80 KOH,40 KCl,25 NaH2PO4,3 MgSO4, 50 L-glutanic acid,20 Taurine,1 EGTA,10 HEPES, 10 Glucose(pH 7.2～7.4)。

膜片鉗記錄細(xì)胞內(nèi)外液。

Solution外(in mmol/L): 1.3 CaCl2, 0.8 MgSO4, 5.4 KCl, 0.4 KH2PO4, 136.9 NaCl, 0.3 Na2HPO4, 10 D-glucose and 4.2 NaHCO3(pH 7.2～7.4)。

Solution內(nèi)(in mmol/L): 140 KCl, 5 ATP-Mg, 10 EGTA, 10 HEPES(pH 7.2)。

記錄鈣離子電流的細(xì)胞內(nèi)液。

Solution內(nèi)Ca2+(in mmol/L): 110 CsCl,5 ATP-Mg,10 EGTA,10 HEPES,30 TEA-Cl(pH 7.2)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位和動(dòng)作電流

圖1是在電流鉗模式下測(cè)得的大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位，以及在動(dòng)作電位鉗下得到的對(duì)應(yīng)于動(dòng)作電位的動(dòng)作電流。在實(shí)驗(yàn)課上主要讓學(xué)生記錄細(xì)胞的靜息電位；觀察動(dòng)作電位的形態(tài)，結(jié)合動(dòng)作電流分析動(dòng)作電位形成的原因；計(jì)算動(dòng)作電位的時(shí)程。

3.2 大鼠心室肌細(xì)胞Na+、K+和Ca2+三種成分離子電流的分離

用nifedipine阻斷鈣通道，-90～-10 mV梯度變化的脈沖程序可以記錄到Na+通道的電流(圖2B)；外液中加TTX并用1 s、-40 mV的鉗制電壓阻斷失活Na+通道，-90～+30 mV的程序分離K+通道電流(圖2(c))；用鈣通道內(nèi)液(見材料和方法2.4)并用TTX阻斷Na+通道，-40～+60 mV的電壓程序記錄Ca2+通道的電流(圖2(d))，用正常內(nèi)外液，-90～+30 mV的電壓可以記錄到全部成分的離子通道電流(圖2(a))。通過本實(shí)驗(yàn)，學(xué)生分離出和動(dòng)作電位相關(guān)的三種主要成分的離子電流，通過觀察其激活速率、時(shí)程和流向加深對(duì)動(dòng)作電位形成的離子機(jī)制的理解，實(shí)驗(yàn)中及實(shí)驗(yàn)后要讓學(xué)生注意觀察并分析三種不同成分離子電流的動(dòng)力學(xué)特征。

圖1 大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位和動(dòng)作電流

(a) 電流鉗模式，給予大鼠心肌細(xì)胞900 pA，5 ms的電流刺激所得到的動(dòng)作電位；(b) 電壓鉗模式下，以動(dòng)作電位作為鉗制電壓程序得到心肌細(xì)胞的動(dòng)作電流

圖2 大鼠心肌細(xì)胞不同成分的離子電流

3.3 BK通道的單通道及全細(xì)胞電流記錄

BK單通道采用cell-attach模式記錄，鉗制電位-110 mV，破膜后記錄BK全細(xì)胞電流，電壓脈沖程序-90～+50 mV[16]。圖3為轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞上的BK單通道及全細(xì)胞電流。實(shí)驗(yàn)中讓學(xué)生觀察并記錄BK單通道和全細(xì)胞電流的幅度。通過本實(shí)驗(yàn)可以使學(xué)生認(rèn)識(shí)某種特定種類的離子通道亞型單通道及全細(xì)胞的電流特征。此外，通過單通道和全細(xì)胞記錄模式的練習(xí)，可以使學(xué)生加深對(duì)膜片鉗兩種7最基本和應(yīng)用最廣泛的記錄方法的認(rèn)識(shí)和理解。

4 結(jié) 語

本文詳細(xì)闡述了為研究生開設(shè)的膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)課程所涉及的具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、方法和結(jié)果，以及實(shí)驗(yàn)的選擇依據(jù)。我們選擇用大鼠心肌細(xì)胞為樣品研究動(dòng)作電位和不同成分離子電流，是和本研究室的研究方向一致的，以神經(jīng)電生理為研究方向的實(shí)驗(yàn)室也可以選擇以神經(jīng)元細(xì)胞為研究對(duì)象。除此之外，研究某種特異性離子通道的單通道和全細(xì)胞電流也可以選擇BK之外的任何一種通道。總之作為實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程，要以實(shí)驗(yàn)操作方便和簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰明了為原則。實(shí)驗(yàn)課程以大鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，觀測(cè)其動(dòng)作電位和與之對(duì)應(yīng)的動(dòng)作電流，進(jìn)一步通過阻斷劑和鉗制電壓相結(jié)合的方法分離出三種主要成分的離子電流，可以使學(xué)生更好地理解動(dòng)作電位產(chǎn)生的離子機(jī)制。在同一個(gè)細(xì)胞記錄同一種離子通道的單通道和全細(xì)胞電流，可以使學(xué)生學(xué)習(xí)某種特異性離子通道的電流特性，掌握膜片鉗兩種應(yīng)用最廣的記錄模式，加深對(duì)膜片鉗技術(shù)的認(rèn)識(shí)和理解?？傊覀兺ㄟ^為生物學(xué)科研究生開設(shè)膜片鉗電生理實(shí)驗(yàn)課程，希望可以彌補(bǔ)學(xué)科在細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)課程方面的不足，增強(qiáng)學(xué)生對(duì)細(xì)胞電生理理論知識(shí)的理解，擴(kuò)展其知識(shí)面，提高其動(dòng)手能力和創(chuàng)新能力。

(a) BK單通道電流

(b) BK全細(xì)胞電流

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Design of Patch Clamp Technique Course on Rat Ventricular Myocytes for Postgraduates

FANZhuo,WUZhen-qiang
(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

The experimental courses of cell electrophysiology for biological graduate students can fill the gaps in the field of cell electrophysiological experiments, and enable students to better grasp the theoretical knowledge of cell electrophysiology. This paper describes the detailed contents of the experimental courses relying on patch clamp technique and the related experimental methods and results. Recording action potential of rat ventricular myocytes and identifying the three major ion channel components (Na+, K+and Ca2+) allow students to better understand the mechanism of action potential and the dynamic properties of the three main types of ion channel currents. In addition, observation and recording the properties of BK single-channel and whole-cell current allows students to know the characteristics of a specific kind of ion channel and also to deepen their understanding and mastering in patch-clamping experimental technique.

cell electrophysiology; patch clamp; action potential; whole-cell current; single-channel current

2014-04-03

華南理工大學(xué)研究生重點(diǎn)課程建設(shè)項(xiàng)目(yjzk2011011)

范 茁(1979-)，女，河北定州人，博士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：細(xì)胞電生理。Tel.：13560407718; E-mail:fanzhuo@scut.edu.cn

Q 291；G 642.3

A

1006-7167(2015)02-0206-03