潘莉萍 袁偉

（武漢大學基礎醫(yī)學院，湖北武漢430072）

慢性骨髓性白血?。–ML）發(fā)病率高，預后差，死亡率高，尋找新的治療方案是各國學者關注的重點［1］。槲皮素是一種常見類黃酮物質，最近研究發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的生物活性如抗炎、抗氧化、抗腫瘤等［2－4］。本研究以人慢性髓系白血病細胞K562為靶細胞，探討槲皮素對慢性髓系白血病細胞K562的作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 K562（購自武漢病毒研究所）槲皮素（sigma，美國），RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibgo，美國）；小牛血清（杭州四季青公司）；12孔培養(yǎng)板（Falcon，美國）；β－actin抗體（Abmart，中國），p－JAK2抗體（CST，美國），JAK2抗體（CST，美國）p－STAT3抗體（CST，美國），STAT3抗體（CST，美國）。TRIzol reagent（Invitrogen，美國），逆轉錄試劑盒（GeneCopoeia，美國），SYBRgreen（Takara，日本），Q－PCR儀（BIO－RAD，美國），蛋白裂解液RIPA（碧云天，中國），蛋白酶抑制劑cocktail及Western blot凝膠制備試劑盒購自武漢谷歌生物公司，BCA蛋白定量試劑盒（上海碧天生物技術有限公司），qPCR引物（北京擎科生物技術有限公司），酶標儀（Thermo Fisher，美國）。

1.2 實驗方法 （1）細胞培養(yǎng)：K562細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，加入青霉素（100U／mL）和鏈霉素（100U／mL），在37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）K562細胞增殖的MTT法檢測：取對數(shù)生長期K562細胞，接種于12孔板內，調整密度為2×105／mL，每孔90μL，分別加入槲皮素（0，10，20μmoL），另設空白孔組（只加培養(yǎng)基，不加藥物），每組設3個復孔。12孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)48h，每孔加入5mg／mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后加入三聯(lián)裂解液［10%SDS＋5%異丁醇＋1%HCL（10mol／L）］，100μL，37℃放置過夜后，用酶標儀于波長570nm處讀取吸光度（OD）值，根據(jù)OD值計算細胞增殖抑制率：增殖抑制率＝（1－實驗組OD值／空白組OD值）×100%。（3）Annexin－V／PI雙染法檢測細胞凋亡：取對數(shù)生長期的K562細胞以1×105／mL接種于96孔板內。細胞培養(yǎng)48h后，加入槲皮素（0，10，20）μg／mL，取1mL細胞懸液，1 000r／min離心5min，棄培養(yǎng)基，加RNA酶，37℃水浴1h，放入冰浴加入0.5mg／L碘化丙啶（PI）及Annexin V，流式細胞儀檢測CELIQU－，EST軟件分析細胞凋亡率。（4）Western blotting檢測槲皮素對K562細胞JAK2、STAT 3，p－JAK2，p－STAT 3，Bax和Bcl－2表達：按照蛋白裂解液RIPA操作說明提取各組蛋白，BCA法進行蛋白定量。取各組細胞總蛋白樣品40μg，以β－actin為內參，經SDS－PAGE凝膠電泳、轉膜，然后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉2h，分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋JAK2抗體（1∶1 000）、p－JAK2（1∶500）、STAT 3（1∶1 000）、p－STAT 3（1∶500）、Bax（1∶500）、Bcl－2（1∶1 000）、β－actin（1∶3 000）抗體，4℃孵育過夜。PBS洗膜3次，10min／次，根據(jù)一抗的來源，再分別加入含2%脫脂奶粉的PBS稀釋的HRP，標記羊抗兔IgG（1∶500），HRP標記羊抗鼠IgG（1∶5 000），室溫下作用2h，PBS洗膜3次，10min／次，ECL化學發(fā)光顯色、壓片、顯影、定影、膠片掃描保存。用Ge－l Pro Analy zer（Ver.3.0）軟件測定蛋白條帶灰度值，JAK2、p－JAK2、STAT 3、p－STAT 3條帶灰度值與β－actin內參條帶灰度值的比值分別將上述蛋白表達量化。（5）實時定量PCR（RT－PCR）檢測Bax和Bcl－2：按照總RNA提取試劑盒（takara）說明提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測量濃度（thermo fisher），逆轉錄以及擴增反應按試劑盒說明書（takara）進行，，實時定量PCR（Bio－Rad）。引物均由invitrogen公司合成。管家基因β－actin作為內參對照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2－ΔΔCT計算相對表達量。引物序列，見表1。

表1 實時定量PCR檢測的引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行分析，實驗結果采用mean±S.D表示，資料采用單因素方差分析（ANOVA），多個樣本之間的兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 槲皮素抑制K562細胞增殖 MTT檢測實驗結果顯示，抑制K562細胞增殖（P＜0.05）作用呈濃度依賴性，最佳抑制濃度為20μmol／L。見圖1。

圖1 MTT檢測槲皮素對K562細胞增殖的影響

2.2 槲皮素誘導K562細胞凋亡 實驗結果顯示，槲皮素誘導K562細胞凋亡作用呈濃度依賴性，最佳濃度為20μmol／L，P＜0.05見圖2。

圖2 槲皮素對各組K562細胞凋亡的影響（＊P＜0.05）

2.3 槲皮素對K562細胞Bax、Bcl－2mRNA表達的影響 實驗結果顯示槲皮素呈濃度依賴性促進Bax mRNA表達增加（＊P＜0.05）而降低Bcl－2mRNA表達（＊P＜0.05）。見圖3。

圖3 RT－PCR檢測槲皮素對K562細胞Bax、Bcl－2mRNA表達的影響（＊P＜0.05）

2.4 槲皮素對K562細胞JAK2、STAT3蛋白表達的影響 實驗結果顯示：經槲皮素作用K562細胞48h后，JAK2、STAT3蛋白濃度無明顯變化（P＞ 0.05），p－JAK2、p－STAT3濃度明顯降低（△P＜0.05），見圖4。

圖4 Western blotting檢測槲皮素對K562細胞JAK2、STAT3蛋白表達的影響

2.5 槲皮素對K562細胞Bax、Bcl－2蛋白表達的影響 實驗結果顯示，經槲皮素作用K562細胞48h后，Bax表達明顯增高（△P＜0.05），而Bcl－2表達明顯降低（1P＜0.05）。見圖5。

圖5 Western blotting檢測槲皮素對K562細胞BCL－2、Bax蛋白表達的影響（1 P＜0.05）

3 討 論

目前對CML大多仍采用傳統(tǒng)的化療和干細胞移植，但化療對肝臟和腎臟很大損害，且復發(fā)率高［1］。而干細胞移植受制于干細胞的緊缺和現(xiàn)有條件，難以大規(guī)模開展。祖國醫(yī)學博大精深，因此從祖國醫(yī)學寶庫中挖掘抑制白血病細胞惡性增殖的方法是研發(fā)高效低毒的抗肺癌藥物的有效途徑之一［1］。槲皮素是一種廣泛存在于植物的花、葉、果實中的一種多羥基黃酮類化合物，化學名為3，3’，4’，5，7－五羥基黃酮，具有多種生物學活性，如抗炎、抗凋亡、抗氧化應激以及抗腫瘤的活性，因此具有很高的藥用價值［5］。最近研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有明顯的抗腫瘤活性作用，可抑制肝癌、乳腺癌和胃癌等［2－6］。而槲皮素對血液系統(tǒng)腫瘤之一的CML的作用及其機制尚不清楚。

實驗中我們通過MTT和流式檢測發(fā)現(xiàn)槲皮素可以呈濃度依賴性誘導白血病細胞K562增殖抑制和促進K562細胞凋亡，以及促進凋亡蛋白Bax明顯增高，抗凋亡蛋白Bcl－2明顯降低，上調Bax／Bcl－2比例。因此我們推測槲皮素具有抑制K562細胞增殖和促進K562凋亡的作用而具有抗白血病腫瘤的活性，但具體機制不明。

JAK2／STAT3信號途徑是在多種細胞發(fā)揮介導作用的信號通路，具有調節(jié)炎癥、凋亡、增殖等功效的。目前研究發(fā)現(xiàn)JAK2／STAT3信號通路在K562細胞增殖扮演重要作用［7］。實驗結果顯示槲皮素可以呈濃度依賴性降低p－JAK2和p－STAT3的表達，而對JAK2和STAT3表達無明顯影響，因此我們推測槲皮素是通過降低JAK2和STAT3信號蛋白磷酸化結構修飾，而非調節(jié)JAK2和STAT3的表達量而抑制JAK2／STAT3信號通路的激活。

綜上所述，我們推測槲皮素可通過抑制JAK2／STAT3信號通路激活而抑制K562細胞增殖和促進K562凋亡。但槲皮素是直接作用于JAK2信號分子還是通過調節(jié)其上游激酶和信號分子而間接發(fā)揮作用仍不清楚，尚需進行更深入的研究。

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