段巍鶴，郭 瑞，張起瑩，劉 建，孫樺楠，王一東*

(1.長(zhǎng)春理工大學(xué)校醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130022；2.長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130022；3.吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春130062)

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羊肚菌活性成分應(yīng)急性抗疲勞功能的研究

段巍鶴1，郭 瑞2，張起瑩2，劉 建2，孫樺楠3，王一東2*

(1.長(zhǎng)春理工大學(xué)校醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130022；2.長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130022；3.吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春130062)

[目的]為了解羊肚菌抗疲勞保健作用。[方法]通過(guò)水提法獲得羊肚菌胞外多糖、胞內(nèi)多糖，破碎菌絲獲得胞內(nèi)活性物質(zhì)，對(duì)小鼠應(yīng)急性一次灌胃處理后進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)。為保證結(jié)果的可靠性，首次進(jìn)行了對(duì)菌絲的ELISA免疫學(xué)方法檢測(cè)。[結(jié)果]胞外多糖組和胞內(nèi)多糖組小鼠游泳時(shí)間與對(duì)照組比較均具有顯著性差異，說(shuō)明胞外多糖、胞內(nèi)多糖應(yīng)急攝入后具有明顯的抗疲勞的作用。[結(jié)論]該研究為羊肚菌抗疲勞保健品的研發(fā)提供了參考。

羊肚菌多糖；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)；抗疲勞

羊肚菌是一種世界公認(rèn)的珍稀美味食用菌，目前還不能實(shí)現(xiàn)完全的人工栽培，通過(guò)深層發(fā)酵技術(shù)可以獲得羊肚菌菌絲體[1-5]。近年來(lái)的研究表明，羊肚菌還具有提高人體免疫力、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等保健功效[6]。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，由于疲勞及過(guò)度疲勞、體力透支、身體抵抗力下降等亞健康狀態(tài)，工作效率降低，健康狀況受到威脅，抗疲勞藥物及保健品的研發(fā)越來(lái)越被人們所重視。參照通行的抗疲勞試驗(yàn)方法，將提取的羊肚菌菌絲不同活性成分分為胞外多糖、胞內(nèi)多糖、胞內(nèi)活性物質(zhì)組分，測(cè)定各組分對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的應(yīng)急攝入后對(duì)增強(qiáng)機(jī)體在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中抵抗疲勞、延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間、增強(qiáng)機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力的影響[7-12]。研究結(jié)果表明，羊肚菌胞外多糖、胞內(nèi)多糖與陰性對(duì)照組、羊肚菌胞內(nèi)活性物質(zhì)組相比具有明顯的抗疲勞作用。該研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)利用羊肚菌多糖，研制羊肚菌抗疲勞保健品提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1菌株。羊肚菌菌株(51589號(hào))，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物。ICR鼠由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3試劑。鼠抗羊肚菌單克隆抗體(C6A8株，單抗為經(jīng)過(guò)初步處理的腹水)，長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院制備并保存[13]；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)與HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TMB Sigma公司產(chǎn)品；PDA液體培養(yǎng)基組成為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、蛋白胨3 g，加蒸餾水1 000 ml，pH自然，121 ℃滅菌20 min。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

1.1.4主要儀器及設(shè)備。恒溫振蕩培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，天平，CF-16RX離心機(jī)-HITACHI, ELx800TM 酶標(biāo)儀-美國(guó)伯騰儀器有限公司，U-2800紫外型可見(jiàn)分光光度儀-日本日立公司，Y92-II超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，游泳槽。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌種的活化、鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.1.1菌種活化。無(wú)菌操作將羊肚菌菌種試管斜面培養(yǎng)物移至無(wú)菌培養(yǎng)皿PDA固體培養(yǎng)基上，23 ℃培養(yǎng)5～7 d，得到菌絲培養(yǎng)物。

1.2.1.2菌絲鑒定[14-15]。取適量培養(yǎng)得到的菌絲，加入到含有一定量的無(wú)菌海砂及一定體積的無(wú)菌生理鹽水的研缽中，研磨30 min，收集研磨液于離心管中，3 000 r/min離心5 min，取上清液作為待檢抗原。將研磨得到的抗原用包被緩沖液(pH 9.6碳酸鹽緩沖液)分別進(jìn)行5、10倍稀釋，在12孔酶標(biāo)條上1～4孔包被5倍稀釋的抗原，5孔為PBS緩沖液做陰性對(duì)照，6～10孔包被10倍稀釋的抗原，11孔為羊肚菌陽(yáng)性對(duì)照，12孔做試劑空白對(duì)照；向包被好的各酶標(biāo)孔加入100 μl 50倍稀釋的抗羊肚菌單克隆抗體，孵育60 min，洗滌3次，甩干，再向各孔中加入100 μl 2 000倍稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)，孵育60 min，洗滌3次，甩干，每孔中加入100 μl TMB底物，室溫避光15 min，每孔中加入50 μl 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的OD值。

1.2.1.3菌絲擴(kuò)大培養(yǎng)。將經(jīng)檢測(cè)、鑒定了的羊肚菌菌絲，無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移至含有無(wú)菌的100 ml液體PDA培養(yǎng)液的250 ml三角瓶中，用半透膜封口，置于21 ℃、115 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，做標(biāo)記，收集培養(yǎng)物(菌絲球)、培養(yǎng)液，備用。

1.2.2羊肚菌胞外多糖、胞內(nèi)多糖及胞內(nèi)活性物質(zhì)的提取。

1.2.2.1胞外多糖的提取。取300 ml過(guò)濾、離心獲得的不含菌絲的羊肚菌培養(yǎng)液，50 ℃恒溫水浴攪拌將體積濃縮至原體積的一半；采取Sevage法去蛋白，將去蛋白后的培養(yǎng)液加入其3倍體積的濃度95%乙醇在-20 ℃沉降24 h，析出絮狀白色物質(zhì)，以4 000 r/min離心20 min得到白色沉淀，加入50 ml蒸餾水溶解后50 ℃水浴除去樣品中殘留的乙醇，得到胞外多糖，備用。

1.2.2.2胞內(nèi)多糖的提取。對(duì)經(jīng)液體培養(yǎng)得到的菌絲體(球狀)用蒸餾水離心洗滌2次，獲得菌絲沉淀物，對(duì)沉淀按浸提比50∶1加入去離子水，85 ℃恒溫水浴浸提120 min，離心去除菌絲，離心上清液50 ℃恒溫水浴至原體積的一半，離心去沉淀，上清液沉淀多糖方法同胞外多糖沉淀方法，得到胞內(nèi)多糖，備用。

1.2.2.3胞內(nèi)活性物質(zhì)。取液體培養(yǎng)得到的菌絲體用蒸餾水離心洗滌2次，用超聲細(xì)胞破碎機(jī)對(duì)菌絲體進(jìn)行破碎，功率180 W，每次超聲破碎時(shí)間10 s，間隔15 s，循環(huán)30次?？捎帽〗禍鼗蛲C(jī)避免破碎液溫度過(guò)高，破碎液經(jīng)100×普通光學(xué)顯微鏡鏡下檢驗(yàn)，至菌絲體完全破碎后，離心取上清液，上清液即為胞內(nèi)活性物質(zhì)，備用。

1.2.3葡萄糖濃度曲線的建立與多糖濃度的測(cè)定。 利用苯酚硫酸法，測(cè)定溶液中多糖的濃度。分別配置100 μg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度6%的苯酚溶液各100 ml。準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分別置于試管中，加蒸餾水補(bǔ)足至2.0 ml，加入濃度6%的苯酚溶液1.0 ml，混勻，小心地加入濃硫酸5 ml，混勻，置于沸水浴中煮沸15 min，迅速冷卻，以試劑空白溶液作參比，用1 cm比色皿在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以葡萄糖質(zhì)量(g)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。根據(jù)曲線的線性范圍，將樣品濃度做適當(dāng)調(diào)整，檢測(cè)樣品吸光度，由線性方程求得樣品多糖濃度。

1.2.4羊肚菌胞內(nèi)、胞外多糖及胞內(nèi)活性物質(zhì)抗疲勞作用濃度的初步選擇。隨機(jī)選擇ICR小鼠8只，稱重，隨機(jī)分成對(duì)照組、胞外多糖組、胞內(nèi)多糖組、胞內(nèi)物質(zhì)組4組，每組2只，將上述各組分提取液分別配制成多糖濃度為14、4 mg/ml的溶液，對(duì)照組為蒸餾水?？崭构辔?，每只1 ml，立即測(cè)定各組小鼠力竭游泳時(shí)間，比較各組分與對(duì)照組及組內(nèi)不同濃度多糖對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定下一步試驗(yàn)的多糖濃度。

1.2.5羊肚菌胞內(nèi)、胞外多糖及胞內(nèi)物質(zhì)抗疲勞作用的測(cè)定。隨機(jī)選擇健康成年ICR小鼠20只，斷食1 d后稱重，隨機(jī)分成4組，每組5只鼠，分為對(duì)照組、胞外多糖組、胞內(nèi)多糖組、胞內(nèi)活性物質(zhì)組。選擇上一步試驗(yàn)確定的有顯著提高游泳時(shí)間的胞外多糖組、胞內(nèi)多糖組、胞內(nèi)活性物質(zhì)組灌胃液多糖濃度，空腹灌胃，每只1 ml，立即測(cè)定各組每只小鼠力竭游泳時(shí)間。最后，對(duì)數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ELISA間接法鑒定結(jié)果由表1可知，經(jīng)活化培養(yǎng)的菌絲，破碎處理后經(jīng)5X(A1～A4孔)及10X(A6～A10孔)稀釋包被，P/N均大于2.1，為陽(yáng)性；試驗(yàn)的陽(yáng)性(A11孔)、陰性(A5孔)對(duì)照成立。這說(shuō)明活化培養(yǎng)后得到的菌絲為羊肚菌菌絲。

表1 ELISA間接法進(jìn)行菌種鑒定

2.2 羊肚菌胞內(nèi)、胞外多糖及胞內(nèi)物質(zhì)多糖濃度根據(jù)測(cè)得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液含量與OD值的關(guān)系，求得線性方程為y=6.798 1x,R2=0.996 4，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。測(cè)得的樣品OD值及由線性方程求得的樣品多糖濃度見(jiàn)表2。

圖1 葡萄糖濃度曲線

表2 水法提取的多糖濃度的測(cè)定結(jié)果

2.3 羊肚菌胞內(nèi)、胞外多糖及胞內(nèi)物質(zhì)抗疲勞作用濃度的初步選擇由表3可知，灌胃液的多糖濃度為14 mg/ml小鼠游泳時(shí)間明顯高于多糖濃度為4 mg/ml。

表3 灌胃多糖濃度為14、4 mg/ml時(shí)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的比較

2.4 羊肚菌胞內(nèi)、胞外多糖及胞內(nèi)物質(zhì)抗疲勞作用由表4可知，胞外多糖組與對(duì)照組比較P=0.000 05，即P<0.01，表明胞外多糖組小鼠游泳時(shí)間與對(duì)照組小鼠游泳時(shí)間有0.01水平顯著性差異；胞內(nèi)多糖組與對(duì)照組比較P=0.03，即P<0.05，表明胞內(nèi)多糖組小鼠游泳時(shí)間與對(duì)照組小鼠游泳時(shí)間相比有0.05水平顯著性差異；胞內(nèi)物質(zhì)組小鼠游泳時(shí)間與對(duì)照組比較P=0.07，P>0.05，表明胞內(nèi)活性物質(zhì)組小鼠游泳時(shí)間與對(duì)照組小鼠游泳時(shí)間沒(méi)有顯著性差異；胞外多糖組與胞內(nèi)多糖組比較P=0.297，P>0.05，表明胞外多糖組與胞內(nèi)多糖組比較小鼠游泳時(shí)間沒(méi)有顯著性差異。

表4 羊肚菌多糖對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響(x±s)

3 討論

(1)羊肚菌發(fā)酵液中的多糖(胞外多糖)及羊肚菌菌絲體內(nèi)多糖(胞內(nèi)多糖)溶液應(yīng)急攝入后小鼠負(fù)重游泳時(shí)間與對(duì)照組比較存在著顯著性差異(P<0.05)，表明2種多糖溶液均具有明顯的應(yīng)激性抗疲勞作用。

(2)4、14 mg/ml羊肚菌胞外多糖和胞內(nèi)多糖均可以延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間；在相同條件下，高濃度的羊肚菌多糖(胞外多糖、胞內(nèi)多糖)對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間明顯大于低濃度的羊肚菌多糖。

(3)胞內(nèi)活性物質(zhì)組小鼠游泳時(shí)間與對(duì)照組小鼠游泳時(shí)間沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明影響小鼠應(yīng)急性抗疲勞作用的主要成分是羊肚菌胞內(nèi)與胞外多糖。胞內(nèi)活性物質(zhì)組內(nèi)含有與胞內(nèi)多糖的抗疲勞作用相互拮抗的物質(zhì)，其成分、作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

(4)該研究結(jié)果驗(yàn)證了羊肚菌多糖具有明顯的應(yīng)急性抗疲勞保健作用。所采用的小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)方法是在相關(guān)試驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行了一次性應(yīng)急灌胃改動(dòng)。該改動(dòng)可以獲得直觀的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并且有抗疲勞保健品使用上的實(shí)際意義。該研究中試驗(yàn)方法的創(chuàng)新為研發(fā)具有應(yīng)急性抗疲勞作用的保健品提供參考與借鑒。

(5)與相關(guān)文獻(xiàn)相比，該研究中首次引入ELISA免疫學(xué)檢測(cè)方法對(duì)菌絲進(jìn)行鑒定檢測(cè)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性提供了保障。

(6)與相關(guān)文獻(xiàn)相比，該研究得到的應(yīng)急性灌胃小鼠游泳時(shí)間即羊肚菌多糖的抗疲勞作用明顯高于其他報(bào)道。這個(gè)結(jié)果或許與該研究所采用菌種的長(zhǎng)期傳代馴化培養(yǎng)、菌絲活性多糖組分的含量變化有關(guān)。

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Study on Quick Anti-Fatigue Function of Morchella Active Ingredients

Duan Wei-he1,GUO Rui2,ZHANG Qi-ying2， WANG Yi-dang*et al

(1.Changchun University of Science and Technology University Hospital, Changchun, Jilin 130022； 2.College of Life Science and Technology, Changchun University of Science and Technology, Changchun, Jilin 130022)

[Objective]The research aimed to learn about the anti-fatigued function of Morchella.[Method]Water extraction was adopted to obtain extracellular polysaccharide and intracellular polysaccharide from Morchella, and active intracellular substances were obtained by breaking mycelia.After one quick intragastric administration was made, mice weight loading swimming experiment was carried out.ELISA test was used to make sure the reliability of the result for the first time.[Result] Extracellular and intracellular polysaccharide groups had sharp difference with control group, indicating that extracellular and intracellular polysaccharide in taken at one time had obvious anti-fatigue function.[Conclusion]This research provided a case for the invention of anti-fatigue care products of Morchella.

Morchella polysaccharide; ELISA; Anti-fatigue

長(zhǎng)春理工大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目”(項(xiàng)目編號(hào)：2012S46；2013x108)。

段巍鶴(1971-)，女，吉林長(zhǎng)春人，主管技師，從事康復(fù)保健機(jī)理及臨床應(yīng)用研究。*通訊作者，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事食品衛(wèi)生檢測(cè)方面的研究。

2015-01-26

S 646.7

A

0517-6611(2015)08-001-03