孔 燕，張 璐，房克慧

(揚(yáng)州市藥品檢驗(yàn)所，揚(yáng)州 225009)

1.芥子堿硫氰酸鹽

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HPLC法測(cè)定蕓薹子中芥子堿硫氰酸鹽含量

孔 燕，張 璐，房克慧

(揚(yáng)州市藥品檢驗(yàn)所，揚(yáng)州 225009)

目的：建立高效液相色譜法研究蕓薹子藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用Apollo C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)為填充柱，以乙腈-3%冰醋酸(15∶85)為流動(dòng)相，流速為1.0 ml/min，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，進(jìn)樣量為10 μl，測(cè)定蕓薹子藥材中芥子堿硫氰酸鹽的含量。結(jié)果：對(duì)8批蕓薹子藥材進(jìn)行試驗(yàn)，芥子堿硫氰酸鹽在26.66～93.31 μg/ml的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r=0.999 9,n=6)，平均回收率為101.61%，RSD為0.6%。結(jié)論：建立的HPLC方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可信，可作為蕓薹子藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

蕓薹子，芥子堿硫氰酸鹽，高效液相色譜法，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)

蕓薹子是十字花科蕓薹屬植物油菜(BrassicaerapaL)的種子[1]，為江蘇省地方藥材，具有行血、破氣、消腫、散結(jié)的功效，常用于產(chǎn)后血滯腹痛、血痢、腫毒、痔漏。蕓薹子藥材收載于《江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1989版)，其標(biāo)準(zhǔn)年代久遠(yuǎn)，其中并無(wú)含量測(cè)定的項(xiàng)目，文獻(xiàn)也無(wú)相關(guān)報(bào)道，為了有效地控制蕓薹子藥材的質(zhì)量，筆者考查了蕓薹子中的活性成分，最終決定采用高效液相色譜法測(cè)定其中芥子堿硫氰酸鹽的含量。芥子堿硫氰酸鹽是芥子堿在蕓薹子中的存在形式，為蕓薹子的主要成分之一。芥子堿為季胺類生物堿，屬于膽堿衍生物，是芥子酸與膽堿形成的酯。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)芥子堿具有降血壓、抗衰老、抗輻射、抗雄激素、消炎止瀉以及抑制乙酰膽酯酶等多方面的藥理作用[2-5]。芥子堿在自然界中只有極少一部分是以單體的形式存在，通常與有機(jī)酸結(jié)合成鹽而存在，或以糖苷、有機(jī)酸酯和酰胺的形式存在，而在常用十字花科藥用植物中以芥子堿硫氰酸鹽的形式存在最為廣泛。因此，測(cè)定蕓薹子中芥子堿硫氰酸鹽的含量可用于該藥材的質(zhì)量控制研究。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，G1316A 1260 TCC二極管陣列檢測(cè)器， Mettler Toledo MS204S 電子天平； 芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111702-200501)； 乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為純化水，冰醋酸為分析純； 蕓薹子藥材樣品經(jīng)南京中山植物研究所徐增萊教授鑒定，其樣品信息見(jiàn)表1。

表1 蕓薹子來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以Apollo C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)為填充劑；以乙腈-3%冰醋酸(15∶85)為流動(dòng)相；流速為1.0 ml/min；柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm；進(jìn)樣量為10 μl。理論板數(shù)按芥子堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。供試品溶液中對(duì)照品峰與其臨近峰分離度>1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品13.33 mg，置100 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取蕓薹子粉末(過(guò)二號(hào)篩)適量，精密稱取0.5 g，置50 ml量瓶中，加50%甲醇溶液35 ml，超聲處理45 min，加50%甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。分別精密吸取對(duì)照品和供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見(jiàn)圖1。

1.芥子堿硫氰酸鹽

圖1 對(duì)照品(A)供試品(B)HPLC色譜圖

2.3 線性關(guān)系考查 精密量取儲(chǔ)備液2、3、4、5、6和7 ml，分別置10 ml量瓶中，以50%甲醇稀釋至刻度，制成濃度為26.66、39.99、53.32、66.65、79.98和93.31 μg/ml的對(duì)照品溶液，精密量取對(duì)照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為：Y=30.471X-4.567 6(r= 0.999 9)，結(jié)果表明芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品在26.66～93.31 μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取53.32 μg/ml的對(duì)照品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算RSD為0.3%。表明儀器的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液，分別于0、2、4、6、8和12 h進(jìn)樣10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各峰面積，結(jié)果芥子堿硫氰酸鹽峰面積的RSD為1.3%(n=6)。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取4號(hào)樣品6份，每份0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果芥子堿硫氰酸鹽含量的RSD為0.9%，表明方法的重復(fù)性較好。

2.7 最低檢測(cè)限和定量限 將對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇進(jìn)行多次等倍稀釋，信噪比/N為10時(shí)，芥子堿硫氰酸鹽最低定量限為0.319 9 μg/ml。信噪比/N為3時(shí)，芥子堿硫氰酸鹽最低檢測(cè)限為0.096 0 μg/ml。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取4號(hào)樣品9份，每份0.12 g，精密稱定，分別精密加入濃度為133.3 μg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液5、6和7 ml，加50%甲醇適量，超聲處理45 min，定容至25 ml，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，芥子堿硫氰酸鹽平均回收率為101.61%，RSD為0.6%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 含量測(cè)定 分取上述8批樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。8批樣品中芥子堿硫氰酸鹽的含量，按干燥品計(jì)平均值為0.450%，最低值為0.266%，最高值為0.750%。從試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)含量差異較大，自采藥材芥子堿硫氰酸鹽的含量均較高，自購(gòu)飲片的含量均較低。

表3 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 提取溶劑的考查 以體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%和純甲醇作為提取溶劑，結(jié)果50%甲醇提取效率最高，故實(shí)驗(yàn)采用50%甲醇作為提取溶劑。

3.2 提取方式的考查 比較超聲提取和回流提取效果，2種方式提取率接近，考慮到超聲提取簡(jiǎn)便，故實(shí)驗(yàn)采用超聲提取方式。

3.3 超聲時(shí)間的考查 比較超聲提取15、30、45和60 min的提取率，超聲處理45 min即可提取完全，因此實(shí)驗(yàn)超聲時(shí)間定為45 min。

3.4 含量測(cè)定的結(jié)果 《中國(guó)藥典》2010年版[6]收載芥子和萊菔子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均以芥子堿作為含量測(cè)定的指標(biāo)性成分，兩種藥材均來(lái)源于十字花科植物。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，芥子堿具有顯著的抗氧化、抗輻射、抗衰老、降血壓、抗炎、抗腹瀉和抗雄激素等多種生物活性[7]。芥子堿在自然界中只有極少一部分是以單體的形式存在，以芥子堿硫氰酸鹽的形式存在最為廣泛。故實(shí)驗(yàn)選擇以芥子堿硫氰酸鹽作對(duì)照品，參照《中國(guó)藥典》方法制定蕓薹子的含量測(cè)定方法，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，方法經(jīng)驗(yàn)證可行，可用于蕓薹子藥材的定量分析和質(zhì)量控制。

1 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[].第2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：1464

2 邢軍，苑艷霞，馮寶民. 五種十字花科植物中芥子堿的有效提取和高效液相色譜定量分析[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28(4)：523

3 Zhang M F, Shen Y Q. Antidiarrheal and anti-inflammatory effevts of sinapine[J].Pharmacol Clin Chin Mater Med，1996(1)：29-31

4 Li J, Shi Z, Zhao L J,etal. Effect of sinapine hydrogen sulfate on blood pressure and heart rate of spontaneous hypertension rat [J]. Jilin J Tradit Chin Med，2002，22(6)：55-56

5 Wu G X, Lin Y X,Ou M R. Anti-androgenic effect of sinapine[J]. China J Tradit Chin Med Pharm，2003，18(3)：142-144

6 中國(guó)藥典[]．一部. 2010：149，255

7 柯木根，吳國(guó)欣，林燕妮，等.芥子堿的研究概況[J].中草藥，2007，38(9)：1436

Determination of sinapine cyanide sulfonate in brassicae rapae semen by HPLC

Kong yan, Zhang lu, Fang Kehui

(Yangzhou Institute for Drug Control, Yangzhou 225009)

Objective: To establish an HPLC method for quantitative determination of sinapine cyanide sulfonate in brassicae rapae semen. Methods: The Apollo C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)was used at 25 ℃ with a mobile phase cmposed of acetonitrile-3% glacial acetic acid(15∶85) at 1.0 ml/min. The detection wave length was set at 330 nm. The injection size was 10 μl. Results: Eight batches of samples were analyzed with a good linearity (r=0.999 9,n=6) with the concentrations of sinapine cyanide sulfonate lying within 26.66～93.31 μg/ml， the average recovery was 101.61%(RSD was 0.6%). Conclusion: The HPLC method was simple and reliable and can be used for quantitative measuring the contents of sinapine cyanide sulfonate in the quality control of brassicae rapae semen.

brassicae rapae semen，sinapine cyanide sulfonate，HPLC，quality control standard

2015-05-20

R927.1

A

1006-5687(2015)05-0015-03