范冬茹，張德巖，高智濤，王丹麗

(伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江伊春153000)

4種東北食用菌內(nèi)生菌的分離和純化

范冬茹，張德巖，高智濤，王丹麗

(伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江伊春153000)

從黑木耳、猴頭菇、元蘑、榛蘑中分離內(nèi)生菌，共得到內(nèi)生真菌7株，內(nèi)生細(xì)菌13株，其中革蘭氏陰性菌7株，革蘭氏陽(yáng)性菌6株。猴頭菇未分離出內(nèi)生菌。研磨法為最適分離方法。NB培養(yǎng)基上分離出的內(nèi)生菌較多，而用來分離內(nèi)生真菌的PDA培養(yǎng)基僅分離出2株內(nèi)生真菌，表明其營(yíng)養(yǎng)成分不適于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。

食用菌；內(nèi)生菌；研磨法

從植物中分離內(nèi)生菌是獲得新的天然產(chǎn)物及開發(fā)新藥的潛在資源，對(duì)植物內(nèi)生菌的研究，具有重大的意義和開發(fā)價(jià)值。近年來，從蔬菜、花卉、藥用植物等多種植物中分離到了大量?jī)?nèi)生菌，但在現(xiàn)有的報(bào)道中，對(duì)食用菌內(nèi)生菌的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以元蘑、榛蘑、猴頭菇和伊春地區(qū)產(chǎn)量豐富的黑木耳為研究對(duì)象，分離和培養(yǎng)內(nèi)生菌，開發(fā)新的微生物資源。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

黑木耳、猴頭菇采摘于烏馬河區(qū)為人工栽培種。元蘑、榛蘑采摘于紅星區(qū)為野生生長(zhǎng)菌株。實(shí)驗(yàn)對(duì)象要求為無霉?fàn)€、蟲蛀、新鮮的子實(shí)體，其中黑木耳應(yīng)選取背部無筋脈的厚實(shí)耳片。

1.2 培養(yǎng)基

用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NB)分離、培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌；用葡萄糖馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)分離、培養(yǎng)內(nèi)生真菌。培養(yǎng)基采用濕熱滅菌法滅菌，高壓蒸汽滅菌器121℃，維持20min。

1.3 方法

本實(shí)驗(yàn)將子實(shí)體滅菌之后采用組織分離法、研磨法、印跡法3種方法分離內(nèi)分菌。在內(nèi)生菌分離過程中，同時(shí)設(shè)置超凈工作臺(tái)無菌狀態(tài)檢測(cè)、漂洗液檢驗(yàn)法、組織印跡法3種對(duì)照處理，以確保準(zhǔn)確分離食用菌內(nèi)生菌。具體操作方法如下：

1.3.1 子實(shí)體滅菌。在內(nèi)生菌分離之前，在超凈工作臺(tái)內(nèi)不同位置放置5個(gè)敞開蓋子的PDA培養(yǎng)基，做超凈工作臺(tái)無菌狀態(tài)檢測(cè)。取新鮮的食用菌，無菌水沖洗5min，濾紙吸干表面水分后，用無菌水沖洗2次，75%乙醇浸泡3min，用無菌水沖洗3次，再用3%NaClO浸泡3min，用無菌水沖洗4次。將處理過的子實(shí)體壓入PDA培養(yǎng)基中，使子實(shí)體與PDA培養(yǎng)基接觸20min，移去子實(shí)體，做組織印跡法對(duì)照。把最后一遍漂洗子實(shí)體的無菌水，涂布于PDA培養(yǎng)基上，做漂洗液檢驗(yàn)法對(duì)照。所有對(duì)照平板經(jīng)28℃培養(yǎng)7天后，不得檢出任何雜菌。

1.3.2 內(nèi)生菌分離

1.3.2.1 印跡法：用無菌解剖刀將滅菌后的食用菌表皮去掉，將內(nèi)部組織切割成0.5cm的小塊，接于NB和PDA培養(yǎng)基上，并用鑷子稍稍用力按壓，然后將組織塊取出。

1.3.2.2 組織分離法：將取出的組織快接于NB和PDA培養(yǎng)基上。

1.3.3.3 研磨法：另取組織塊轉(zhuǎn)入研缽中，加入適量滅菌過的石英砂和無菌水進(jìn)行研磨，靜止一段時(shí)間后，取上清液在NB和PDA上涂布。

每種方法3個(gè)平行。NB培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)24h，PDA培養(yǎng)基于28℃恒溫培養(yǎng)72h。純化，斜面保存菌種。

1.4 統(tǒng)計(jì)與鑒別

比較不同分離方法對(duì)食用菌內(nèi)生菌的分離效果。觀察內(nèi)生菌的菌落形態(tài)，通過革蘭氏染色對(duì)分離到的內(nèi)生細(xì)菌形態(tài)進(jìn)行觀察、鑒別。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分離方法對(duì)食用菌內(nèi)生菌的分離情況

本實(shí)驗(yàn)用3種方法對(duì)黑木耳、猴頭菇、元磨、榛蘑4種食用菌的內(nèi)生菌進(jìn)行分離。具體內(nèi)生菌的分離數(shù)量見表1。

表1 不同分離方法對(duì)4種食用菌內(nèi)生菌的分離結(jié)果

注：“-”表示未分離到食用菌內(nèi)生菌

由表1可以看出，研磨法分離得到15株內(nèi)生菌，組織分離法得到4株內(nèi)生菌，印跡法分離得到1株內(nèi)生菌，研磨法的分離效果最好。同時(shí)可以看出從榛蘑中分離出的內(nèi)生菌數(shù)量最多，元磨、黑木耳次之。而猴頭中并未得到內(nèi)生菌，可能因其子實(shí)體被菌刺覆蓋，消毒液沿菌刺進(jìn)入子實(shí)體內(nèi)部，而影響內(nèi)生菌的分離。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)食用菌內(nèi)生菌的分離情況

NB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基分離內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌的情況見表2。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)4種食用菌內(nèi)生菌的分離結(jié)果

由表2可以看出，NB培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生菌的分離效果較好，分離出內(nèi)生真菌5株，內(nèi)生細(xì)菌9株。PDA培養(yǎng)基分離得到2株內(nèi)生真菌，4株內(nèi)生細(xì)菌。本次實(shí)驗(yàn)中共分離得到7株內(nèi)生真菌，13株內(nèi)

生細(xì)菌。

2.3 內(nèi)生細(xì)菌的菌落特征及細(xì)胞形態(tài)

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的菌落特征進(jìn)行描述，并通過革蘭氏染色在顯微鏡下進(jìn)行觀察，詳見表3。

表3 內(nèi)生細(xì)菌菌落特征和細(xì)胞形態(tài)

3 結(jié)論

植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生許多生物活性物質(zhì)，往往具有抑制病原菌、協(xié)助宿主抵抗病原菌和促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)的作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黑木耳、猴頭菇、元蘑、榛蘑的內(nèi)生菌進(jìn)行初步分離，共得到內(nèi)生真菌7株，內(nèi)生細(xì)菌13株，其中革蘭氏陰性菌7株，革蘭氏陽(yáng)性菌6株。猴頭菇未分離出內(nèi)生菌，可能是培養(yǎng)基不適或消毒液濃度過高的原因。3種分離內(nèi)生菌的方法中，研磨法能使內(nèi)生菌最大可能地釋放出來，分離出的內(nèi)生菌數(shù)量最多，為最適分離方法。NB培養(yǎng)基上分離出的內(nèi)生菌較多，而用來分離內(nèi)生真菌的PDA培養(yǎng)基僅分離出2株內(nèi)生真菌，可能是其營(yíng)養(yǎng)成分不適于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。

內(nèi)生細(xì)菌菌數(shù)顯微鏡下觀察圖

[1]劉麗娟，郝芳芳.白鮮內(nèi)生菌分離與培養(yǎng)[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(20):149-150.

[2]張敏星,張靈枝,周游,等. 茶樹內(nèi)生菌的分離和純化[J].中國(guó)茶業(yè)，2011(12):12-13.

[3]劉麗娟，賈金如，王洪偉. 紫丁香內(nèi)生菌分離與培養(yǎng)[J].農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技，2014(10):39-40.

2015-08-03

范冬茹(1987-)，女，助理工程師，主要從事食用菌研究工作，E-mail:124950629@qq.com。

S759.81

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.05.013