徐艷芝，孟思彤，王振月

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040)

興安升麻種子內(nèi)源抑制物質(zhì)活性的研究

徐艷芝，孟思彤，王振月*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040)

興安升麻種子具生理后熟、休眠的生理特性，通過對比實驗研究其內(nèi)源抑制物質(zhì)存在的部位和抑制作用。用興安升麻種子制備蒸餾水粗提物、甲醇粗提物，取白菜種子、小麥種子浸于粗提物中進(jìn)行萌發(fā)實驗，根據(jù)幼苗生長情況測定各粗提物抑制活性。結(jié)果表明，興安升麻種子的種皮和胚乳均存在較高活性的內(nèi)源抑制物，且抑制作用隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。蒸餾水粗提物在相同質(zhì)量濃度下抑制作用均高于甲醇粗提物。同時，興安升麻種子不同部位抑制物質(zhì)的含量存在一定的差異，表現(xiàn)為種皮高于胚乳。

興安升麻種子；內(nèi)源抑制物

興安升麻[Cimicifugadahurica(Turcz) Maxim.]為毛茛科升麻屬多年生草本植物 。廣泛分布于黑龍江、吉林、遼寧及內(nèi)蒙古地區(qū)，主產(chǎn)于河北(承德、龍關(guān)和張家口等地)、山西(大同)及內(nèi)蒙古。在我國作為傳統(tǒng)中藥使用，具有清熱解毒、升舉陽氣、發(fā)表透疹的功能，是治療婦女崩漏、子宮脫垂等癥的婦科良藥[1-2]。在人工栽培興安升麻的過程中發(fā)現(xiàn)春天播種后出苗緩慢，出苗不齊。本文探究興安升麻種子休眠期長，不易萌發(fā)和發(fā)芽率低的原因，為其規(guī)范化種植奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

興安升麻種子采購哈爾濱市阿城興安升麻種植基地。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為興安升麻[Cimicifugadahurica(Turcz.)Maxim]的種子。測定內(nèi)源抑制物質(zhì)使用的白菜種子選購的是膠蔬秋季王(改良型)，挑選種子粒大、飽滿的進(jìn)行發(fā)芽試驗，測定發(fā)芽率99%，并測定含水量≤7%。小麥種子選購的是山東省2014年新種子，挑選顆粒飽滿，表面光亮的進(jìn)行發(fā)芽試驗，測定發(fā)芽率為98%，含水量≤13%。

1.2 方法

1.2.1 粗提物制備。興安升麻種子粗提物分別用蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇兩種溶劑提取。種皮和胚乳用蒸餾水提取。其甲醇粗提物的制備參照齊永平等[3]、張艷杰等[4]的方法，并略作改進(jìn)。取興安升麻種子10g，加80mL 80%甲醇浸提液，保鮮膜封口，置4℃冰箱中浸提24h，紗布粗濾，后3000r/min離心15min，取上清液，殘渣再浸提2次，合并3次浸提液，35℃下減壓旋轉(zhuǎn)揮干甲醇，加入蒸餾水制成質(zhì)量濃度為0.10g/mL的甲醇粗提物溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

興安升麻種子、胚乳、種皮蒸餾水粗提物參照趙敏等[5]、王炎等[6]、張榮榮等[7]的方法制備，用細(xì)砂紙剝離胚乳和種皮，取種子、胚乳和種皮各10g，種子和胚乳用研缽磨碎，放入錐形瓶內(nèi)，至于56℃的恒溫箱中浸提24h，過濾浸提液，殘渣在浸提2次，用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀56℃濃縮成一定體積并定容至100mL，制成質(zhì)量濃度為0.10g/mL的蒸餾水粗提物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 粗提物抑制活性測定。參照趙敏等[5]、羅夫來等[8]的方法并略作改動，用白菜和小麥種子測定粗提物活性。粗提物設(shè)置0.014、0.028、0.042、0.056、0.070g/mL 5個質(zhì)量濃度梯度，以蒸餾水為對照。取培養(yǎng)皿( d=90 mm)內(nèi)鋪兩層適當(dāng)大小的濾紙，各加入不同質(zhì)量濃度的粗提取物溶液5.0mL。白菜種子每皿50粒，小麥種子每皿50粒，25℃恒溫箱培養(yǎng)，48h后測定白菜種子發(fā)芽率及胚長和胚顏色(綠色，黃色)比例，小麥種子發(fā)芽率及主根長、根數(shù)和胚芽鞘長，每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑粗提物對白菜和小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.1.1 白菜種子及幼苗。實驗測定，興安升麻種子蒸餾水粗提物、甲醇粗提物對白菜種子萌發(fā)和幼苗生長均有較強(qiáng)的抑制作用，且在試驗范圍內(nèi)，抑制強(qiáng)度隨粗提物質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)(圖1和表1)。在0.028g/mL、0.032g/mL濃度下對白菜種子胚的生長尤為明顯，綠色子葉所占比例低于10%：在0.056g/mL，0.070g/mL濃度下種子處于生根階段，且根長約0.1cm尚未長出胚軸、子葉。

圖1 不同溶劑粗提物對白菜種子發(fā)芽率的影響

注：相對發(fā)芽率由測除以相應(yīng)對照(蒸餾水)值再乘100%計算而得。

圖1顯示，蒸餾水粗提物表現(xiàn)為隨著質(zhì)量濃度的升高抑制活性增強(qiáng)。甲醇粗提物的抑制活性表現(xiàn)為：在0.042g/mL濃度抑制活性最強(qiáng)，0.014g/mL、0.028g/mL、0.056g/mL濃度對發(fā)芽率無影響，但隨著粗提物質(zhì)量濃度的增大，蒸餾水粗提物和甲醇粗提物的抑制活性差異逐漸增大，且在相同質(zhì)量濃度的粗提物中，蒸餾水粗提物對白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制活性高于甲醇粗提物。

表1 興安升麻種子不同溶劑粗提物對白菜種子芽生長影響

注: 表1、2、3、4中相對芽長、相對主根長由測量值除以相應(yīng)對照(蒸餾水)值再乘100%計算而得。

2.1.2 小麥種子及幼苗。圖2表2顯示，蒸餾水粗提物、甲醇粗提物對小麥種子的萌發(fā)、主根的生長均有較強(qiáng)的抑制作用。但對小麥的不同部位作用強(qiáng)度存在差異：蒸餾水對小麥胚芽鞘生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且抑制強(qiáng)度與抑制物質(zhì)的質(zhì)量濃度無關(guān)；對小麥主根的生長，表現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系，可使小麥的相對主根長低33.33%。甲醇提取物對小麥的相對主根長，相對胚芽鞘長呈現(xiàn)曲線變化，即在0.042g/mL時最強(qiáng) 。由此可見興安升麻種子中存在抑制物質(zhì)，且抑制物質(zhì)在蒸餾水中的溶解度大于80%甲醇的溶解度，且抑制物質(zhì)對小麥主根生長作用明顯，對胚芽鞘的作用次之，對發(fā)芽率的作用最小。

表2 興安升麻種子不同提取物對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的影響/%

2.1.3 小麥根條數(shù)量。蒸餾水粗提物和甲醇粗提物對小麥的根條數(shù)量無影響，只對根長有明顯抑制作用。

2.2 不同部位蒸餾水粗提物對白菜和小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.2.1 白菜種子和幼苗。觀察圖2、表3，白菜種子在發(fā)芽率、相對根長、子葉顏色方面受到明顯抑制作用。具體表現(xiàn)為：抑制作用隨抑制物質(zhì)的質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，兩部位粗提物最高點時使白菜種子的相對發(fā)芽率均降到30%左右，同時可以觀察到種子根生長緩慢并未脫離種皮長出子葉。并且種皮提取物在低質(zhì)量濃度時表現(xiàn)出顯著抑制作用。

綜上可知，興安升麻種子中的抑制物質(zhì)在種皮和胚乳中均存在，且種皮高于胚乳。

圖2 興安升麻不同部位蒸餾水粗提物

質(zhì)量濃度/(g·mL-1)胚乳種皮芽長/cm相對芽長/%胚芽呈綠色比例/%芽長/cm相對芽長/%胚芽呈綠色比例/%01.2100.00100.001.2100.00100.000.0140.6150.8330.000.6159.1789.000.0280.6251.6715.000.6351.6732.000.0420.5344.165.000.2319.16未長出子葉0.0560.4436.672.000.2218.33未長出子葉0.0700.2520.83未長出子葉0.1817.50未長出子葉

2.2.2 小麥種子和幼苗。見表4，興安升麻種子胚乳蒸餾水粗提物、種皮蒸餾水粗提物對小麥種子萌發(fā)、主根及胚芽鞘生長均有明顯的抑制作用，與胚乳粗提物相比，相同質(zhì)量濃度的種皮蒸餾水粗提物對小麥發(fā)芽率、主根和胚芽鞘的抑制均高于胚乳粗提物。種皮提取物在實驗設(shè)置抑制物質(zhì)的最低質(zhì)量濃度時，即表現(xiàn)出顯著地抑制作用，使相對胚芽鞘長低至50%。而在實驗設(shè)置的抑制物質(zhì)的最高質(zhì)量濃時，使小麥種子相對發(fā)芽率降至6%，主根短小， 胚芽鞘未長出的顯著抑制作用。

綜上可知，興安升麻種子中種皮含有的抑制物質(zhì)高于胚乳，其對小麥胚芽鞘的生長抑制作用活性最高，主根次之，發(fā)芽率抑制活性最低;與白菜種子的生長抑制活性相比，小麥?zhǔn)艿揭种莆镔|(zhì)的抑制較弱；興安升麻中的抑制物質(zhì)是存在的并對不同種子均有抑制作用。

表4 興安升麻種子不同部位蒸餾水提取物對小麥種子的發(fā)芽率和幼苗生長的影響/%

2.2.3 小麥根條數(shù)量。胚乳和種皮蒸餾水粗提物對小麥根條數(shù)量無有明顯影響。

3 結(jié)論與討論

蒸餾水、80%甲醇兩種溶劑粗提物的抑制強(qiáng)度不同，蒸餾水粗提物抑制強(qiáng)度高于80%甲醇。提示我們，興安升麻種子中的抑制物質(zhì)在水中的溶解度較大，亦可以是興安升麻種子中存在多種生長抑制物質(zhì)，溶于水中的抑制物質(zhì)抑制活性更強(qiáng)，需要進(jìn)一步的實驗證實以上的猜測。

同種溶劑提取興安升麻種子不同部位得到的粗提物，總體表現(xiàn)為，種皮粗提物抑制活性大于胚乳粗提物。表明興安升麻種皮和胚乳中內(nèi)源抑制物質(zhì)種類和含量存在差異。

興安升麻種子、胚乳和種皮均存在活性較高的內(nèi)源抑制物質(zhì)，對白菜和小麥種子的萌發(fā)及主根、胚芽鞘有顯著的抑制作用且抑制物質(zhì)的活性隨質(zhì)量濃度(在試驗范圍)的逐漸增大而總體呈增強(qiáng)趨勢，對根條數(shù)量(小麥)無顯著的抑制作用。這種普遍的抑制作用是興安升麻種子不易萌發(fā)的原因之一。

興安升麻種子具有較強(qiáng)的休眠特性，常規(guī)播種很難發(fā)芽。本試驗首次證實興安升麻種子中存在活性較高的內(nèi)源抑制物，為進(jìn)一步探討興安升麻種子中內(nèi)源抑制物與促進(jìn)物質(zhì)的平衡及內(nèi)源抑制物質(zhì)的去除方法、揭示興安升麻種子休眠機(jī)制、解除休眠等研究奠定基礎(chǔ)。

[1]中國科學(xué)院植物研究所.中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1978:52-80.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:215.

[3]齊永平,顧蔚,羅成,等.秦嶺華中五味子種子內(nèi)源抑制物活性研究[J].種子,2009,28(7):1-3.

[4]張艷杰,高捍東,魯順保.南方紅豆杉種子中發(fā)芽抑制物的研究[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2007,31(4):51-56.

[5]趙敏,王炎,康莉.刺五加果實及種子內(nèi)源萌發(fā)抑制物質(zhì)活性的研究[J].中國中藥雜志,2001,26(8):534-537.

[6]王炎,趙敏,俞加林.北五味子種子休眠特性及內(nèi)源抑制物質(zhì)的研究[J].中國中藥雜志,1997,22(1):10-12.

[7]張榮榮,王康才.芍藥種子內(nèi)源抑制物質(zhì)活性的研究[J].中草藥,2008,39(12):1880-1883.

[8]羅夫來,郭巧生.百蕊草種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的初步研究[J].中國中藥雜志,2007,32(17):1737-1739.

2014-09-30

徐艷芝(1988-)，女，2011級研究生，生藥方向，E-mail：xuyanzhixuyanzhi@163.com;*

R282.71

A

doi.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.01.011