張炳煌 高靜

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·基礎(chǔ)研究·

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1對(duì)鼻息肉成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控作用

張炳煌 高靜

目的 體外研究堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)對(duì)人鼻息肉成纖維細(xì)胞(NPF)增殖及膠原合成的影響。方法 采用組織塊培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行人NPF的體外培養(yǎng)，使用不同濃度的bFGF、TGF-β1單獨(dú)及聯(lián)合作用于NPF。用四唑化合物[MTS(a)]比色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液Ⅲ型膠原的含量。結(jié)果 TGF-β1單獨(dú)使用時(shí)，隨著其濃度梯度升高，對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；bFGF單獨(dú)使用時(shí)，其濃度增高，可促進(jìn)人NPF增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；bFGF和TGF-β1聯(lián)合使用時(shí)對(duì)NPF細(xì)胞的增殖具有拮抗作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著bFGF、TGF-β1單獨(dú)及聯(lián)合作用誘導(dǎo)NPF產(chǎn)生的增殖變化，NPF分泌的Ⅲ型膠原的含量發(fā)生明顯的濃度差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 TGF-β1可以抑制人NPF增殖及Ⅲ型膠原的分泌，bFGF能夠促進(jìn)人NPF增殖及Ⅲ型膠原的分泌，兩者聯(lián)合具有拮抗作用，可能在鼻息肉的發(fā)生、鼻竇炎組織的重塑中發(fā)揮重要作用。(中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2015，15：272-275)

鼻竇炎；成纖維細(xì)胞；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；組織重塑

近年來(lái)，盡管規(guī)范的鼻內(nèi)鏡手術(shù)和抗炎藥物應(yīng)用使慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)的治療效果有了較大的提高，但是仍有約1/5的CRS患者在術(shù)后5年內(nèi)由于癥狀復(fù)發(fā)而再次手術(shù)，約1/3的患者在藥物治療后的2個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)。之所以臨床療效難于令人滿(mǎn)意，在于CRS發(fā)病機(jī)制還不明確[1]。無(wú)論是在CRS伴鼻息肉(CRS with nasal polyps，CRSwNP)還是在CRS不伴鼻息肉(CRSsNP)中都發(fā)現(xiàn)了組織的重塑變化[2]，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)在鼻竇炎黏膜重塑及鼻息肉的發(fā)生機(jī)制中可能起到重要作用。本課題通過(guò)研究bFGF和TGF-β1對(duì)體外鼻竇黏膜及鼻息肉成纖維細(xì)胞(nasal polyps fibroblast，NPF)生長(zhǎng)調(diào)控和膠原蛋白分泌的影響，探討bFGF及TGF-β1對(duì)黏膜重塑的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM；HyClone)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS; PAA)、0.25%含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)胰酶(Invitrogen)、雙抗(PAA)、TGF-β1(PeproTech)、bFGF(PeproTech)、SV0001二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物公司)、鼠抗波形蛋白單克隆抗體(武漢博士德生物公司)、人Ⅲ型膠原定量酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)試劑盒(北京艾然生物技術(shù)有限公司)、四唑化合物MTS(Promega)。

1.2 方法

1.2.1 成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) 本研究材料取自本科慢性鼻竇炎伴鼻息肉摘除手術(shù)患者(17～52歲，10例)，術(shù)后都經(jīng)病理確認(rèn)符合鼻息肉病變。取鼻息肉標(biāo)本置于無(wú)菌平皿中，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)洗凈血細(xì)胞，選擇蒼白色的鼻息肉組織剪成0.5～1 mm大小的組織塊，再用基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗2～3次，洗凈血細(xì)胞靜置一段時(shí)間后棄上清液。加 4～5 滴細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打后分次吸取組織塊懸液，將其均勻排在15 mL培養(yǎng)皿，做好標(biāo)記將培養(yǎng)皿置于37 ℃、2.5%CO2培養(yǎng)箱中靜置2～3 h，待組織塊貼壁后小心加入培養(yǎng)液(低糖DMEM+10% FBS)，使培養(yǎng)液浸泡組織塊，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。每天小心取出培養(yǎng)皿置于相差顯微鏡下進(jìn)行觀察，24 h后可見(jiàn)組織塊周邊有細(xì)胞伸出，7 d后周?chē)罎M(mǎn)細(xì)胞，2周后多數(shù)連接成片，可進(jìn)行傳代。2～3代可獲得成纖維細(xì)胞長(zhǎng)成片，然后用胰蛋白酶消化，繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度為80%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 人NPF鑒定 細(xì)胞傳代至第4～7代用于實(shí)驗(yàn)。使用倒置相差顯微鏡進(jìn)行NPF的形態(tài)學(xué)初步鑒定，并用波形蛋白單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞來(lái)源鑒定。

1.2.3 TGF-β1、bFGF單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NPF增殖的影響 實(shí)驗(yàn)組為不同濃度的TGF-β1和bFGF溶液，均用含1%FBS的DMEM配制成100、50、10、1 ng/mL 4個(gè)濃度，對(duì)照組為含1%FBS的DMEM，每濃度組4孔。分別在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育1、3、5 d后取出，每孔加入MTS(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用ELISA檢測(cè)儀在λ=490 nm下測(cè)定吸光度(optical density,OD)值。

1.2.4 Ⅲ型膠原蛋白測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NPF接種在96孔板中，5×104/孔，置37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，24 h后換含1%血清DMEM培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化，37 ℃繼續(xù)孵育48 h，使細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)靜止期。棄上清液，分別加入10%FBS、不同濃度的TGF-β1和bFGF藥物，每天換液，繼續(xù)培養(yǎng)5 d。用無(wú)菌管收集上清液，離心20 min左右(2 000～3 000 r/min)。按照Ⅲ型膠原蛋白試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在λ=450 nm波長(zhǎng)下依序測(cè)量各孔的OD值，計(jì)算各組Ⅲ型膠原蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。先對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，滿(mǎn)足條件者行單因素方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn)，設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NPF鑒定 倒置相差顯微鏡下，NPF胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央可見(jiàn)卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出2～3個(gè)長(zhǎng)短不齊的突起(圖1)。免疫組織化學(xué)染色后出現(xiàn)棕色或棕褐色標(biāo)記物者為波形蛋白陽(yáng)性細(xì)胞(圖2)。

圖1. 倒置相差顯微鏡下的NPF(200×)

圖2. 波形蛋白染色陽(yáng)性的NPF(400×)

2.2 TGF-β1和bFGF單獨(dú)作用時(shí)對(duì)人NPF增殖的影響 在培養(yǎng)基中單獨(dú)加不同濃度的TGF-β1或bFGF，24 h后實(shí)驗(yàn)組各濃度組的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞增殖情況與對(duì)照組相比變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；72 h和120 h，TGF-β1在1～100 ng/mL范圍內(nèi)，隨濃度增加對(duì)NPF細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；bFGF在1～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)為明顯的促進(jìn)NPF細(xì)胞增殖作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 TGF-β1和bFGF單獨(dú)應(yīng)用對(duì)NPF增殖的影響值)

注：a示TGF-β1單獨(dú)作用組與相應(yīng)對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；b示bFGF 單獨(dú)作用組與相應(yīng)對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

2.3 TGF-β1和bFGF聯(lián)合作用對(duì)人NPF增殖影響 濃度為10 ng/mL的TGF-β1和10 ng/mL的bFGF聯(lián)合作用于人NPF，產(chǎn)生較明顯的拮抗作用，與單獨(dú)作用時(shí)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 TGF-β1和bFGF聯(lián)合作用對(duì)NPF增殖

注：a示與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；b示與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TGF-β1和bFGF濃度均為10 ng/mL

2.4 TGF-β1和bFGF對(duì)NPF膠原合成的影響 培養(yǎng)120 h后， TGF-β1在1～100 ng/mL范圍內(nèi)隨濃度增加明顯抑制NPFⅢ型膠原合成及分泌，bFGF在1～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)能明顯促進(jìn)NPF細(xì)胞Ⅲ型膠原合成及分泌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組NPF表達(dá)Ⅲ型膠原的濃度值見(jiàn)表3。

表3 TGF-β1和bFGF對(duì)NPF膠原合成

注：a示與聯(lián)合作用組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

3 討論

組織重塑指正常構(gòu)成成分及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，多是應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，哮喘患者下呼吸道上皮結(jié)構(gòu)和功能缺陷，繼而引起上皮細(xì)胞持續(xù)活化并最終導(dǎo)致上皮下組織發(fā)生不可逆改變。下呼吸道和上呼吸道在很多疾病上存在著重要關(guān)聯(lián)[4]，在屬于上呼吸道的CRS中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的組織改變現(xiàn)象[2]。CRS是耳鼻咽喉頭頸外科的常見(jiàn)病，可分為CRSwNP和CRSsNP兩種[5]。早在1972年，Cauna等[6]就觀察到CRSwNP除了有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)外，在病理切片中還出現(xiàn)了成纖維細(xì)胞增生和基底膜增厚的組織結(jié)構(gòu)異常。成纖維細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的最初來(lái)源，該類(lèi)細(xì)胞可定植于纖維病灶并與鄰近活性纖維病灶相連。同時(shí)，合成并沉積細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致組織重塑，進(jìn)而影響鼻黏膜功能。理論上講，抑制纖維化進(jìn)程中的成纖維細(xì)胞增殖、活化及分化，在分子生物學(xué)角度可能對(duì)CRS的治療具有重要的臨床意義。

TGF-β1能夠趨化并促進(jìn)成纖維細(xì)胞分裂增殖及成熟分化，刺激成纖維細(xì)胞大量合成膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型，同時(shí)可抑制膠原蛋白酶及纖溶酶原激活物的合成，增加蛋白酶抑制物的形成，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成；促進(jìn)合成釋放多種細(xì)胞因子，提高其生物活性。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，TGF-β1能夠抑制NPF增殖及膠原蛋白的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組應(yīng)用TGF-β1第1天，細(xì)胞增殖情況無(wú)明顯變化，可能TGF-β1和其相應(yīng)受體結(jié)合需要一定的時(shí)間和過(guò)程，而在第3天及第5天，與對(duì)照組相比就表現(xiàn)出了明顯的抑制細(xì)胞增殖作用，同樣檢測(cè)各組上清液中Ⅲ型膠原蛋白顯示，TGF-β1在抑制細(xì)胞增殖的同時(shí)，也抑制了膠原蛋白的分泌。而bFGF在1～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)為明顯的促進(jìn)作用，bFGF單獨(dú)應(yīng)用中也顯示出了與細(xì)胞增殖情況相對(duì)應(yīng)的膠原蛋白分泌。以往關(guān)于bFGF和TGF-β對(duì)于不同組織成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控作用的研究結(jié)果，常出現(xiàn)不一致的結(jié)論。如傅亞娜等[7]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β抑制人鞏膜成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，而Schaafsma等[8]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β能刺激肺成纖維細(xì)胞增殖及Ⅰ型膠原蛋白分泌，出現(xiàn)這種差異，可能是bFGF和TGF-β對(duì)不同細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞增殖作用差異，提示組織重塑的機(jī)制是相當(dāng)復(fù)雜的。

于睿莉等[9]研究也發(fā)現(xiàn)，在CRSwNP中發(fā)生上皮組織的脫落，鼻黏膜Ⅲ型膠原陽(yáng)性且基底膜增厚，TGF-β1強(qiáng)陽(yáng)性，而正常人鼻黏膜免疫組織化學(xué)染色顯示這2項(xiàng)指標(biāo)均呈陰性。在研究增厚的上皮下基底膜的超微結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)構(gòu)造變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，基底膜的增厚主要是由于膠原蛋白的沉積，這也是在下呼吸道和上呼吸道中發(fā)生組織重塑的重要標(biāo)志。在哮喘患者的細(xì)支氣管中基底膜的增厚主要是由膠原Ⅲ和Ⅴ型構(gòu)成的網(wǎng)狀纖維，這與病理中的纖維變性和瘢痕形成主要由膠原Ⅰ型構(gòu)成，存在很大的區(qū)別[10]，而在CRS黏膜重塑中主要以膠原Ⅲ和Ⅴ型構(gòu)成為主[3]。

我們也研究了TGF-β1與bFGF聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NPF細(xì)胞增殖及膠原蛋白分泌的影響，發(fā)現(xiàn)TGF-β1與bFGF具有拮抗作用，與單獨(dú)作用相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Strutz等[11]發(fā)現(xiàn)，TGF-β誘導(dǎo)人腎成纖維細(xì)胞增殖的過(guò)程是通過(guò)bFGF介導(dǎo)的，這是導(dǎo)致成纖維細(xì)胞自主增殖的主要原因。Bosse等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在人支氣管平滑肌細(xì)胞的增殖過(guò)程中，TGF-β和FGF2發(fā)揮了協(xié)同作用。肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖過(guò)程是由TGF-β介導(dǎo)的誘導(dǎo)細(xì)胞外FGF2釋放和P38促分裂原活化蛋白激酶和c-Jun氨基端激酶的磷酸化而發(fā)揮作用。在CRS組織重塑中，TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞變化可能與bFGF具有重要協(xié)同作用。這提示CRS組織黏膜重塑可能是多因素交叉的結(jié)果。但是在生理及病理?xiàng)l件下，生長(zhǎng)因子的作用是極其復(fù)雜的，是多種因素共同作用的結(jié)果。生長(zhǎng)因子的含量、相應(yīng)受體的數(shù)量及細(xì)胞對(duì)其反應(yīng)性的動(dòng)態(tài)變化構(gòu)成了生長(zhǎng)因子調(diào)控的復(fù)雜性。在不同組織細(xì)胞中，可能還有其他細(xì)胞因子參與不同病理的形成，其具體機(jī)制極其復(fù)雜，將有待更多的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)。

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(本文編輯 楊美琴)

Effects of basic fibroblast growth factor and transforming growth factor-β1 on the proliferation of fibroblasts from patients with nasal polyps

ZHANGBing-huang,GAOJing.

DepartmentofOtorhinolaryngology,theFirstAffiliatedHospitalofXiamenUniversity,Xiamen361003,China

GAO Jing, Email:GJDZB@126.com

Objective To investigate the effects of transforming growth factor-β1(TGF-β1) and basic fibroblast growth factor(bFGF) on the proliferation， collagen excretion of human nasal polyps fibroblast (NPF). Methods Human NPF was isolated and cultured．Nasal polyps fibroblast proliferation was measured by CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(a),Collagen Ⅲ in the conditioned media was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results The impact of TGF-β1(1～100 ng/mL)on the growth of human NPF at different time(24, 72, 120 h) came up with different results．Various concentrations of TGF-β1 at 24 h could not inhibit the growth of NPF clearly; while TGF-β1(1,10，50,100 μmol/L) could inhibit the NPF growth at the extension of time(72，120 h). MTS colorimetric Am values showed a decreasing trend compared with the control group and the differences were statistically significant(allP<0.05). Various concentrations of TGF-β1 at 120 h could make type Ⅲ collagen in NPF supernatants gradually decrease，compared with the control group, and the difference was statistically significant (allP<0.01). bFGF in the concentrations of bFGF (1,10，50，100 ng/mL) could promote the NPF growth and the differences were statistically significant(allP<0.05)．Combined application of TGF-β1 and bFGF showed an antagonistic effect compared with the control group. Conclusions TGF-β1 could inhibit the NPF growth,while bFGF could promote the NPF growth. TGF-β1 and bFGF may have an antagonistic effect on NPF, and may play a great role in the tissue remodeling of CRS. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:272-275)

Sinusitis；Fibroblasts；Fibroblast growth factor 2； Transforming growth factor-β1；Mucosal remodeling

廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 福建醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)B門(mén)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 廈門(mén) 361003

高靜(Email:GJDZB@126.com)

張炳煌為福建醫(yī)科大學(xué)耳鼻喉科研究生 福州 350108

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.04.013

2014-09-09)