李 然，張 杰，李玉芝，高福祿

(1.河北省承德縣醫(yī)院，河北 承德縣 067400 2.河北省承德市中心醫(yī)院，河北 承 德 067000)

c-fos正常表達與睪丸Leydig細胞分泌睪酮功能的關(guān)系密切［1］，應(yīng)用D-半乳糖建立的亞急性雄性衰老大鼠模型成功后，測得中血清睪酮濃度明顯降低［2］，何首烏飲能明顯延緩下丘腦-垂體-睪丸衰老，使衰老大鼠血清睪酮、IGF-l含量升高［3］。本實驗采用Western blot半定量法和免疫組織化學染色法觀察睪丸組織中c-fos蛋白的表達，進而探討何首烏飲抗衰老作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的分組和處理:選用SPF級健康雄性8周齡SD大鼠40只，由河北省實驗動物中心提供，其合格證號為1005050，體重在180～220g之間。隨機將大鼠分為4組，每組10只:何首烏飲預(yù)防組(HP)，正常對照組(N)，何首烏飲治療衰老組(HT)，模型組(M)。何首烏飲預(yù)防組(HP)、模型組(M)和何首烏飲治療衰老組(HT)此三組大鼠，采用腹腔連續(xù)注射6%D-半乳糖，劑量為300mg/kg/d，60d，應(yīng)用此種方法，進行建立亞急性衰老動物模型。何首烏飲預(yù)防組(HP)的大鼠在進行建立亞急性衰老動物模型的同時，再進行何首烏飲灌胃，連續(xù)60d，劑量為1mL/100g;何首烏飲治療衰老組(HT)的大鼠，在建立亞急性衰老模型成功后，給予灌胃何首烏飲，劑量為1mL/100g，連續(xù)60d。

1.2 藥物與試劑:c-fos免疫組化試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供;D-半乳糖，批號為0914B70，由北京化學試劑公司提供;BCA試劑盒，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。何首烏飲的方劑由何首烏、淫羊霍、懷牛膝、肉蓯蓉、丹參、茯苓組成，自河北省中醫(yī)院購買，將所用藥材均混合剪碎，用水浸泡1h，共煎2次，每次煎30min，然后混合前后2次水煎液，并進行過濾、濃縮，使液體含生藥4.8g/mL，保存于4℃溫度中，復(fù)溫至25～30℃后予大鼠灌胃。

1.3 每組取5只大鼠，以4%多聚甲醛液體灌注并固定，取大鼠睪丸組織，進行常規(guī)石蠟包埋，并免疫組化染色;其余大鼠斷頭處死迅速取出雙側(cè)睪丸放入液氮中。

1.4 采用免疫組織化學法和Western Blot檢測睪丸組織的c-fos蛋白的含量。

2 結(jié)果

用Western Blot法半定量分析表明，模型組與正常組相比明顯降低(P＜0.01);何首烏飲用藥后均能提高睪丸c-fos蛋白的表達(P＜0.01)，何首烏飲預(yù)防與延緩衰老組無顯著性差別(P＞0.05)(Table 1，Table2和 Fig.1-3)

圖1 各組大鼠睪丸組織c-fos蛋白的表達vs正常對照組:*P＜0.01;vs模型組#P＜0.05

圖2 模型組大鼠睪丸組織生精細胞c-fos蛋白表達(×400)Fig.10 expression of c-fos in testis of rats

圖3 何首烏飲治療衰老組大鼠睪丸組織生精細胞c-fos蛋白表達(×400)

圖4 大鼠睪丸組織c-fos蛋白表達

表1 用Western blotting法測得各組的c-fos蛋白(±s，n=5)

表1 用Western blotting法測得各組的c-fos蛋白(±s，n=5)

vs正常對照組:*P＜0.01;vs模型組#P＜0.05

組別 c-fos/β-actin正常對照組 1.89±0.24模型組 0.36±0.02*何首烏飲預(yù)防組 1.47±0.21#何首烏飲治療衰老組 1.28±0.08#

3 討論

研究衰老機制和抗衰老藥物的前提是成功建立衰老動物模型，目前衰老動物模型主要有:D-半乳糖致衰老模型;胸腺摘除致衰老模型;臭氧損傷致衰老模型;自然衰老模型等。其中，自然衰老模型是最理想的衰老模型，但需要長時間飼養(yǎng)，個體差異較大，干擾因素較多，影響實驗結(jié)果，且一般大鼠在16月進入衰老期，很難得到大樣本的標本。摘除胸腺致衰老模型，存在手術(shù)摘除胸腺不干凈，術(shù)中大鼠容易死亡或損傷而影響造模的成功;臭氧損傷致衰老模型省時易行，但臭氧量不易控制。D-半乳糖誘導的亞急性衰老模型，1991年我國學者龔國清等依據(jù)自然衰老代謝特點變化提出，D-半乳糖衰老模型較真實的體現(xiàn)了自然衰老過程，又因?qū)嶒炛芷诙?，為目前?yīng)用最多的衰老模型。給藥方式有多種，如頸背皮下注射、腹腔注射、眼球后注射等，劉學麗等證明腹腔注射給藥方式最好，但給藥時間劑量都不盡相同，一般給藥時間20～60d不等，給藥劑量每日40～500mg/kg不等。本研究選用D-半乳糖腹腔大劑量注射來制作衰老模型，它衰老的變化過程符合自然衰老睪丸組織形態(tài)功能變化的特征，因而為可靠的衰老動物模型。

c-fos是編碼核蛋白的癌基因，屬于立早基因的成員。c-fos是分子量為62kD的磷酸化蛋白質(zhì)，F(xiàn)os與其他核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白組成調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的AP-l復(fù)合物，從而干擾其他基因的轉(zhuǎn)錄速率。c-fos作為細胞內(nèi)信號傳遞的“第三信使”，具有調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡以及細胞內(nèi)信號傳遞等重要的生理作用。目前通過PCR、免疫組織化學和原位雜交等技術(shù)方法已證實，睪丸組織的的間質(zhì)細胞、支持細胞和生精細胞中均有某些原癌基因的表達，如 cmyb，c-jun，c-fos等，并且與睪丸的功能密切相關(guān)［4］。血清睪酮含量與衰老密切相關(guān)，同時衰老會導致睪酮下降這一結(jié)果目前已經(jīng)得到廣泛認同［5］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)何首烏飲能夠提高衰老模型大鼠血清中睪酮的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性，可降低生精細胞的凋亡指數(shù)等［6］，平衡下丘腦的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)傳遞。

逐漸步入衰老年齡，由于睪丸組織血液供應(yīng)不足，間質(zhì)細胞數(shù)目減少，分泌功能降低，而呈現(xiàn)退行性改變，間質(zhì)細胞合成睪酮不足，產(chǎn)生cAMP減少，從而導致精細胞的凋亡，使得老年人在生理性LH刺激下間質(zhì)細胞應(yīng)答減弱。本研究顯示，睪丸生精細胞發(fā)生凋亡，其中衰老大鼠細胞凋亡明顯多于正常組大鼠;cfos蛋白在睪丸組織的表達量模型組明顯降低;何首烏飲能夠降低生精細胞的凋亡，提高睪丸組織c-fos蛋白的表達，而且預(yù)防用藥的效果要好于衰老后治療的效果。

［1］ 況海斌，方廉.原癌基因與睪丸功能的關(guān)系［J］.中華男科學，2003，9(5):337～380

［2］ 況海斌，方廉，徐斯凡，等.c-Fos對大鼠間質(zhì)細胞睪酮生成的影響及其作用機理［J］.江西醫(yī)學院學報，2005，45(1):24～27

［3］ 王小杰，牛嗣云，張艷青，等.何首烏飲對雄性衰老大鼠生殖功能的保護作用［J］.時珍國醫(yī)國藥2011，22(3):532～535.

［4］ 高福祿，岳鳳鳴，龐曉靜，等.db/db自發(fā)性糖尿病小鼠睪丸 EGFR，c-fos表達研究［J］.解剖學雜志 2001，24(6):532～536.

［5］ 柳海燕，陶曉倩，時姍姍，等.大鼠睪丸間質(zhì)細胞中促性腺激素釋放激素激動劑調(diào)控睪酮合成的機制［J］.南京醫(yī)科大學學報＜自然版＞，2009，29(10):1337～1341.

［6］ 陳志宏，齊聰儒，高福祿，等.天年飲對亞急性衰老大鼠睪丸組織SOD活性及生精細胞凋亡的影響［J］.四川中醫(yī)，2004，22(8):11～12.