王靜暉，許淑芳，王曉兵，劉 適，王 格，周 瑞，夏 冰

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430071)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)主要包括克羅恩病(Crohn’S，disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)［1］。亞洲國(guó)家 IBD 患病率低于歐美國(guó)家［2］，但近年來(lái)IBD的發(fā)病率尤其是CD的發(fā)病率逐漸上升，且發(fā)展中國(guó)家上升趨勢(shì)更為明顯。西方的研究者通過大量的研究發(fā)現(xiàn)了一些與歐美高加索人種 IBD患者相關(guān)的易感基因，包括 NOD2/CARDl5，OCTN1，OCTN2，IL23R 等基因，但有研究表明一些與西方IBD患者相關(guān)的易感基因與中國(guó)IBD易感性無(wú)關(guān)［3，4］。我們課題組前期通過CD家系全外顯子測(cè)序和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了尚未報(bào)道的包括DLG1在內(nèi)的6個(gè)候選基因單核苷酸變異可能與兩個(gè)CD家系的發(fā)病有關(guān)，且DLG1基因chr3_196865242位點(diǎn)存在著多態(tài)性改變。這個(gè)重要發(fā)現(xiàn)提示chr3_196865242可能是DLG1基因中與中國(guó)人CD遺傳易感性相關(guān)的SNP位點(diǎn)，為中國(guó)人CD發(fā)病機(jī)制的研究提供了一條重要線索［5］。目前針對(duì)DLG1多態(tài)性與IBD易感的關(guān)系研究較少，國(guó)內(nèi)尚無(wú)相同報(bào)道。我們采用病例/對(duì)照研究設(shè)計(jì)和測(cè)序法進(jìn)行DLG1 SNP的檢測(cè)分析，探討DLG1基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人IBD發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象:共收集2012年至2013年6月臨床資料完整、彼此無(wú)血源關(guān)系的中國(guó)漢族散發(fā)IBD患者345例(CD 185例，UC 160例)和健康體檢者463例，以及4例CD家系(成員共15例)。IBD的診斷依據(jù)2012年中國(guó) IBD診斷與治療共識(shí)意見［6］，從臨床表現(xiàn)、結(jié)腸鏡檢查、影像學(xué)表現(xiàn)、生化檢查以及病理組織學(xué)檢查等5個(gè)方面進(jìn)行綜合診斷，所有患者均排除合并其它自身免疫性疾病。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取:所有研究對(duì)象均抽取外周血，全血分離后提取基因組DNA，DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)由 Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。上游5’-TGCCTGGCATGTGGTTAGTG -3’;下 游 5’-GAACTTTTCAAATGCTGCAATCT-3’。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR擴(kuò)增):25μL反應(yīng)體系含 2 x PCR Tag mix 12.5μL，滅菌水 8.5μL，DNA 模板2.0μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL。放入 PCR擴(kuò)增儀，95℃預(yù)變性，5 min;進(jìn)入循環(huán):變性95℃，30 s;退火 62.3℃，30 s;延伸 72℃，40s;共 35 個(gè)循環(huán)。終末延伸72℃，7min。取PCR產(chǎn)物在含溴乙啶的2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.4 測(cè)序 PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于4℃保存?zhèn)溆?。?jīng)武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司純化并測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間人群基因進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn);χ2檢驗(yàn)分析不同基因型在三組人群及各亞組中的構(gòu)成比，同時(shí)計(jì)算比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 納入的研究對(duì)象的臨床資料特征:UC患者中病變部位位于直腸30例，左半結(jié)腸50例，右半結(jié)腸18例，全結(jié)腸62例，其中男80例，女80例，平均發(fā)病年齡26.49±4.20歲;CD患者中病變部位位于小腸 70例，結(jié)腸59例，小腸合并結(jié)腸38例，直腸18例;CD按疾病的活動(dòng)度分，緩解期57例，活動(dòng)期128例，其中男92例，女 93 例，平均發(fā)病年齡 25.81±4.19 歲。463 例健康體檢者，男296例，女167例，平均年齡39.74±12.47歲。4例CD家系(成員共15例)，男7例，女8例，平均年齡28.53±16.10歲，先證者是一名 40歲男性患者，內(nèi)鏡下顯示病變位于回腸末端和升結(jié)腸，病檢提示粘膜組織呈慢性炎，通過抗結(jié)核診斷性治療后確診為CD，已行氨基水楊酸制劑、免疫抑制劑和升結(jié)腸切除手術(shù)治療。

2.2 通過DNA測(cè)序結(jié)果顯示，55例散發(fā)IBD患者(其中CD 35例，UC 20例)和54例健康對(duì)照者，以及15例家系的9名親屬檢測(cè)到了DLG1基因9號(hào)外顯子上chr3_196865242位點(diǎn)G＞A的雜合突變(GA)(見圖1圖2)。該突變導(dǎo)致密碼子由CGA變?yōu)镃AA，所編碼的氨基酸序列由精氨酸變?yōu)楣劝滨０?。所有研究樣本均未發(fā)現(xiàn)純合突變(AA)。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡性檢驗(yàn)，該位點(diǎn)符合遺傳平衡性，此樣本基因頻率的分布具有良好的群體代表性(P＞0.05)。

圖 1 DLG1 基因突變序列圖(Exon 9，c.833G.A，p.R278Q)，SNP位點(diǎn)的等位基因圖中為綠黑色雙峰

圖2 DLG1基因測(cè)序的正?；蛐蛄袌D片段，SNP位點(diǎn)的等位基因圖中為黑色單峰

2.2.1 DLG1 基因 chr3_196865242 位點(diǎn)多態(tài)性基因型頻率與IBD的相關(guān)性分析(表1):散發(fā)CD組GA基因型者所占比例為18.9%，與健康對(duì)照組(11.7%)相比，P＜0.05，差異有顯著意義;散發(fā)UC組GA基因型者所占比例為 12.5%，與健康對(duì)照組(11.7%)相比，P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;家系組 GA基因型者所占比例60%，與健康對(duì)照組(11.7%)相比，P＜0.05，差異有顯著意義。④散發(fā)UC組、散發(fā)CD組和家系組相較于健康對(duì)照組的 OR 值分別為 1.082、1.767 和 11.361;散發(fā)CD組和家系組與健康對(duì)照組相比時(shí)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P 值分別為 P＜0.05 和 P＜0.001。

3 討 論

目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，IBD是攜帶遺傳易感基因的宿主在環(huán)境因素作用下，自身免疫功能紊亂導(dǎo)致的一種非特異性炎癥性疾?。?，8］。CD病變呈階段性或跳躍式分布，為全層腸壁性炎癥，多見于回腸末端和近端結(jié)腸［9，10］;UC病變主要累及大腸粘膜和粘膜下層，多見于直腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸，嚴(yán)重時(shí)也可累及全結(jié)腸及末端回腸［11］。炎癥性腸病患者常伴隨著自主神經(jīng)功能的紊亂，在其死因中，癌變占到近10%～15%的比例，對(duì)患者的生存質(zhì)量有很大影響［12～14］。眾多研究顯示，炎癥性腸病存在明顯家族聚集現(xiàn)象和人種差異性，更易發(fā)生在家族成員中，而且患者一級(jí)親屬的發(fā)病危險(xiǎn)性更高，發(fā)病年齡更早［15，16］。單卵雙生子比雙卵雙生子有更高的疾病一致率［17］，單卵雙生子中，CD和UC的發(fā)病一致率分別為20%～44%和6%～10%;雙卵雙生子CD和UC的發(fā)病一致率分別為3.8%～6.5%和3%。據(jù)統(tǒng)計(jì)UC患者同胞患病的危險(xiǎn)性提高7～17倍，而CD 患者同胞患病的危險(xiǎn)性更甚，可達(dá) 13～36 倍［18，19］。歐美一些研究也顯示CD的一些臨床表現(xiàn)如狹窄、竇道形成和炎癥程度等與遺傳因素相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)IBD家族中病變累及部位與有無(wú)腸外病變有高度一致性。諸多研究證明IBD特別是CD具有明顯的遺傳易感性［20］。

DLG1基因包含有3個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域，每個(gè)PDZ由約90個(gè)氨基酸組成，能夠通過特異性識(shí)別配體蛋白C末端的氨基酸殘基介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過PDZ區(qū)與其他分子相互作用參與微管極化，中心體再定向以及細(xì)胞遷移，對(duì)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和增殖、突觸發(fā)育和淋巴細(xì)胞活化可能發(fā)揮重要的作用。有研究表明DLG1在記憶T細(xì)胞生成，T細(xì)胞極性以及T細(xì)胞受體信號(hào)的特異性中發(fā)揮作用［21，22］。而T細(xì)胞與自身免疫性疾病密切相關(guān)，大量研究結(jié)果顯示T細(xì)胞遷移進(jìn)入腸道，參與腸道炎癥的發(fā)生和組織破壞［23，24］。另外，DLG1基因的缺失也會(huì)導(dǎo)致致瘤性細(xì)胞因子如IL-6和TNF-α等對(duì)機(jī)體的侵襲［25］，其存在突變時(shí)，會(huì)出現(xiàn)微絲和微管的異常組裝而導(dǎo)致的細(xì)胞極性異常，柱狀上皮細(xì)胞去極化和細(xì)胞粘附分子的異常分布，以及導(dǎo)致細(xì)胞極性的喪失和細(xì)胞的過度增殖［26］。

我們應(yīng)用MassARRAY基因質(zhì)譜和外顯子組測(cè)序技術(shù)篩選和驗(yàn)證了IBD的易感基因，篩查出尚未報(bào)道的THBS1，KLF4，SYNE1，CHD8，PDCL 和 DLG1 6個(gè)候選易感基因。課題組前期通過分析401例散發(fā)IBD患者基因型，發(fā)現(xiàn)了一名21歲女性CD患者攜帶DLG1基因突變(c.374T＞C，p.I125T)。隨后對(duì) 25 例年輕頑固性CD患者進(jìn)行DLG1基因全外顯子組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)兩名CD患者存在DLG1基因另一位點(diǎn)的突變(exon 9，c.833G.A，p.R278Q)。分別對(duì)這兩名CD患者家庭成員進(jìn)行進(jìn)一步篩查，發(fā)現(xiàn)其中一名程姓CD患者的一個(gè)哥哥和兩個(gè)表兄妹，均在腸鏡下觀察到回腸末端的潰瘍，病檢顯示為非特異性慢性炎癥，最后確診為CD。本組實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上對(duì)包括程姓CD患者在內(nèi)的15名直系親屬進(jìn)行基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)4名CD患者和另外5名家屬存在DLG1chr3_196865242位點(diǎn)突變(exon 9，c.833G.A，p.R278Q)。采用病例/對(duì)照設(shè)計(jì)對(duì)DLG1基因第九外顯子chr3_196865242位點(diǎn)進(jìn)行基因多態(tài)性研究。結(jié)果顯示，散發(fā)CD組和家系組OR 值分別為 1.767和 11.361，與健康對(duì)照組相比，P值分別為 0.015 和 0.000，均小于 0.05，差異有顯著意義;散發(fā)UC組與健康組相比，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在中國(guó)漢族人群中，該位點(diǎn)多態(tài)性可能與CD的易感性有明顯相關(guān)，是決定CD個(gè)體遺傳易感性的重要因素。

研究基因多態(tài)性對(duì)認(rèn)識(shí)疾病易感基因、探明發(fā)病機(jī)制、評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后有著重要意義，并可能為臨床提供一種新的基因診斷方式及治療手段。分析本次研究.實(shí)驗(yàn)中家系有DLG1基因突變的9人中，4人確診為CD;隨機(jī)抽樣的IBD患者有DLG1基因突變的89例中，35例確診為CD;二者之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.089，P=0.766)。這可能與家系實(shí)驗(yàn)樣本量較少，偏倚較大，限制了很多分析進(jìn)行有關(guān)，同時(shí)，也不排除存在抽樣誤差的可能，和多重檢驗(yàn)可能造成的陰性結(jié)果。因此，我們不能簡(jiǎn)單地定義該基因突變與CD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。需要擴(kuò)大樣本量，采用多中心、標(biāo)準(zhǔn)化的研究方法.做進(jìn)一步的研究，從而為闡明IBD的病因、基因治療、遺傳咨詢以及易感人群的合理防治等提供依據(jù)。

表1 各組間chr3_196865242位點(diǎn)多態(tài)性χ2檢驗(yàn)

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