★　宋會珠第一作者：宋會珠(99—)，女，碩士研究生。研究方向：中藥及天然藥物的研究與開發(fā)?！″X麗梅　張建芬　李越蘭通信作者：李越蘭(956—)，女，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：yuelanli@63.com?！?.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院　杭州 30053；.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院　杭州 3005)

降糖1號水提部分提取工藝研究

★宋會珠1*第一作者：宋會珠(1991—)，女，碩士研究生。研究方向：中藥及天然藥物的研究與開發(fā)。錢麗梅1張建芬2李越蘭1*通信作者：李越蘭(1956—)，女，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：yuelanli@163.com。(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院杭州 310053；2.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院杭州 310015)

摘要：目的：優(yōu)選降糖1號中黃芪、地骨皮等水提部分藥材的提取工藝條件。方法：建立水提液中黃芪甲苷的RP-HPLC-ELSD含量測定方法。采用正交試驗法，以黃芪甲苷得率為指標，考察加水量、提取時間、提取次數(shù)對黃芪甲苷得率的影響，優(yōu)選水提部分藥材的提取工藝條件。結(jié)果：水提取部分的最優(yōu)工藝條件為：12倍量水提取3次，每次1h。結(jié)論：優(yōu)選得到的工藝條件，設(shè)計合理，穩(wěn)定可控，有效成分得率較高。

關(guān)鍵詞：提取工藝;黃芪;黃芪甲苷;RP-HPLC-ELSD

降糖1號是臨床經(jīng)驗方，由地骨皮、黃芪、女貞子、關(guān)黃柏等七味中藥組成。具有明顯的降低糖尿病患者血糖水平，改善糖尿病并發(fā)癥等作用。為了將其開發(fā)成治療糖尿病的中藥新藥，更有效的發(fā)揮其臨床應(yīng)用，根據(jù)處方中各藥味的理化性質(zhì)，將其分為水提部分及醇提部分。課題組已優(yōu)選了關(guān)黃柏、女貞子醇提的工藝條件[1]。本項目對其水提部分的工藝條件進行了研究，以期為降糖1號的新藥開發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。地骨皮水提物具有明顯的降血糖作用[2]，黃芪水提物及黃芪中的三萜皂苷類物質(zhì)亦具有明顯的降血糖作用[3]。故本研究以水為溶媒，對地骨皮、黃芪等五味藥材進行了提取，采用正交試驗，以黃芪甲苷的得率為指標優(yōu)選水提部分的工藝條件。

1儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀(1525二元分析泵、717自動進樣器、2420蒸發(fā)光散射檢測器)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI Labortechnik,Sweden)；電子天平(Mettler Toledo,AB 104-N)。

地骨皮、黃芪均購自華東醫(yī)藥股份有限公司，地骨皮產(chǎn)地為陜西；黃芪產(chǎn)地為甘肅。黃芪甲苷對照品(批號：0781-200210)購自中國藥品生物制品檢定所。高效液相分析用乙腈為色譜純，水為雙蒸水；其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1黃芪甲苷含量測定方法[3-4]

2.1.1色譜條件Waters高效液相色譜儀：1525二元分析泵、717自動進樣器、2420蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)，Empower色譜工作站；Agilent C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相為乙腈-水38∶62，柱溫為25℃，流速：1.0mL/min；2420參數(shù)設(shè)置：Gain：135，漂移管溫度(drift)55℃，載氣壓力25 psi。

2.1.2黃芪甲苷對照品溶液的制備取黃芪甲苷對照品約0.01g，精密稱定，定容于10mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制得黃芪甲苷對照品溶液的母液，精密移取3mL黃芪甲苷母液于10mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成約300μg/mL的黃芪甲苷對照品溶液，即得。

2.1.3水提部分樣品的制備準確稱取一個處方量的水提部分的藥材，采用回流提取法，按照L9(34)正交表安排試驗。提取液過濾，濃縮定容至100 mL的容量瓶中，即得。

2.1.4樣品供試液的制備精密移取各試驗項下的水提樣品10 mL，加水飽和正丁醇萃取3次，每次30 mL，合并三次正丁醇萃取液，以氨試液洗滌2次，每次20 mL。棄去氨水層，正丁醇層蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移定容至5 mL的棕色量瓶中，過0.45 μm的微孔濾膜，即得。

參考文獻2.2水提部分因素水平的確定以及預(yù)試驗結(jié)果，確定考查加水量、提取時間、提取次數(shù)，三個與黃芪甲苷得率密切相關(guān)的因素，并確定了各因素的水平，見表1。

表1　黃芪、地骨皮等五味水提中藥正交試驗因素水平表

2.3水提液中黃芪甲苷含量測定方法的建立

2.3.1專屬性試驗除黃芪外準確稱取一個處方量的水提部分的藥材，按照水提樣品的制備方法制備陰性樣品供試液；另取7號正交試驗的水提樣品，照樣品供試液制備方法制備樣品供試液；另取黃芪甲苷對照品(308μg/mL)；以上三種供試液各取10μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，如圖1所示。從圖譜得知，陰性樣品中黃芪甲苷相應(yīng)的位置無色譜峰(B)，7號樣品供試液(C)在與對照品(A)保留時間相同處出色譜峰，表明水提部分中其他藥材對黃芪甲苷的含量測定無影響。

A.黃芪甲苷對照品溶液；B.陰性樣品；C.樣品供試液

2.3.2線性關(guān)系的考察分別精密量取1.0 mg/mL的黃芪甲苷母液0.1,0.2,0.5,0.6,0.8 mL于1 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配成濃度為100,200,500,600,800μg/mL的黃芪甲苷對照品溶液，吸取20μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以進樣量(單位：μg)的對數(shù)為橫坐標，以峰面積的對數(shù)為縱坐標進行線性回歸，回歸方程為：Y=1.372 4X+2.791 3，r=0.999 9，表明黃芪甲苷在進樣量2～16μg之間有良好的線性關(guān)系。

2.3.3精密度考察精密吸取308μg/mL的黃芪甲苷對照品溶液10μL,連續(xù)重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，RSD為0.2%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性試驗取6號正交試驗水提樣品，按前述方法制備樣品供試液，精密吸取10μL樣品供試液分別于0,3，6，9，12h進樣，記錄峰面積，峰面積在12h內(nèi)RSD為0.57%，表明黃芪甲苷樣品供試液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5重現(xiàn)性試驗取7號正交試驗水提樣品，按前述方法制備樣品供試液，平行制備5份供試液，精密吸取10μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積；另取10，20μL的黃芪甲苷對照品溶液(308μg/mL)注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，利用對數(shù)外標兩點法定量，黃芪甲苷濃度的RSD為1.33%(n=5)，表明重現(xiàn)性良好。

2.3.6回收率試驗稱取一個處方量的水提部分藥材，加6倍量水提取2次，每次1.5h，合并提取液，濃縮定容至100mL的容量瓶中，按前述方法制備樣品供試液，并用上述方法測得黃芪甲苷含量為0.109 9mg/mL。精密移取上述已知含量的水提液10mL，精密加入濃度為1.0 mg/mL的黃芪甲苷1.00 mL，按樣品供試液項下的方法制備樣品，平行制備6份樣品，測定其中黃芪甲苷的含量，計算回收率，結(jié)果平均回收率為99.4%，RSD為2.0%(n=6)，表明該方法回收率良好。

2.4水提部分黃芪甲苷的含量測定精密吸取黃芪甲苷對照品溶液(308μg/mL)10μL和20μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積；精密吸取各試驗項下的樣品供試液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。利用對數(shù)外標兩點法定量，計算黃芪甲苷的含量，結(jié)果見表2。對正交試驗結(jié)果進行了方差分析，結(jié)果見表3。

表2　黃芪、地骨皮水提正交試驗結(jié)果

表3　方差分析表

查表：F0.1(2,2)=9.00,F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00。

方差分析結(jié)果表明，加水量和提取次數(shù)對黃芪甲苷得率的影響具有顯著性差異，提取時間對黃芪甲苷提取得率影響不大；各因素對黃芪甲苷得率影響的大小順序為C>A>B。故提取次數(shù)選3水平，即：提取3次；加水量選3水平，即：加12倍量的水；提取時間對黃芪甲苷得率的影響不大，從生產(chǎn)實際出發(fā)選1水平，即：提取1h。因此，水提工藝的最佳條件應(yīng)為A3B1C3，即加12倍量的水提取3次，每次1h。據(jù)此條件驗證三批，結(jié)果見表4。驗證試驗結(jié)果與正交試驗結(jié)果基本一致。據(jù)此確定黃芪、地骨皮等五味中藥的水提工藝條件為A3B1C3，即12倍量水提取3次，每次1h。

表4　黃芪、地骨皮水提正交驗證試驗結(jié)果

3討論

3.1黃芪甲苷的含量測定方法黃芪甲苷為三萜皂苷類物質(zhì)，在紫外區(qū)僅有末端吸收，溶劑會影響其定量的準確度，故2005、2010年版藥典都采用蒸發(fā)光散射檢測器對其進行含量測定[4-5]。本研究表明：蒸發(fā)光散射檢測器對復(fù)方水提液中的黃芪甲苷的檢出具有靈敏度高、線性范圍寬、定量準確等優(yōu)點。

3.2樣品供試液的制備黃芪甲苷樣品供試液制備過程中，正丁醇的用量，萃取的次數(shù)，氨水洗滌條件，均能影響到黃芪甲苷的含量及色譜峰的峰形，通過試驗確定加水飽和正丁醇萃取3次，每次30mL，氨試液洗滌2次，每次20mL，能有效地將黃芪甲苷從水提液中溶出，且能保證其色譜峰峰形及與其它組分具有良好的分離度。

3.3水提工藝條件正交試驗方差分析結(jié)果表明：提取次數(shù)、加水量對黃芪甲苷的溶出均具有顯著性差異，故這兩個因素均選擇3水平。用優(yōu)選得到的工藝條件制備三批樣品，驗證試驗結(jié)果與正交試驗結(jié)果一致，故優(yōu)選得到的降糖1號水提部分工藝條件穩(wěn)定、可靠，能為降糖顆粒的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

[1]張建芬，陳尉青，蔣新龍.降糖1號關(guān)黃柏部分的提取工藝研究[J].中成藥，2010，32(10):1 826-1 828.

[2]李康，畢開順，司保國.地骨皮中不同組分對四氧嘧啶糖尿病小鼠的降血糖作用[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23(7):1 298-1 299.

[3]謝春英.黃芪甲苷降血糖作用的實驗研究[J].中藥材，2010，33(8)：1 319-1 320.

[4]國家藥典委員會.中國藥典·一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:212-214.

[5]國家藥典委員會.中國藥典·一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010:283-285.

Water Fraction Extraction Process of Hypoglycemic No.1

SONG Hui-zhu1，QIAN Li-mei1，ZHANG Jian-fen2，LI Yue-lan1

1.CollegeofPharmacy,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053，China;

2.CollegeofBiologicalandEnvironmentalEngineering,ZhejiangShurenUniversity,Hangzhou310015，China

Abstract:Objective: To optimize extraction process conditions of Astragalus membranaceus, cortex lycii radicis and other water extraction medicinal herbs in hypoglycemic No. 1. Methods: To establish a RP-HPLC-ELSD method for determination of astragaloside A in water extraction. The astragaloside A extraction rate was selected as index, using orthogonal test method, the influence of amount of water, extraction time, extraction times on the yield of astragaloside A was investigated, to optimize extraction process conditions of water extraction medicinal materials. Results: The optimum process conditions of water extraction was as follows: 12 times of water and extracting for 3 times, each time is 1 hour. Conclusion: The optimized process conditions is reasonable, stable and controllable, the yield of effective components is high.

Key words:Extraction Process; Astragalus Membranaceus; Astragaloside A; RP-HPLC-ELSD

收稿日期：(2014-10-23)編輯：曾文雪

中圖分類號：R284.2

文獻標識碼：A