陳海軍, 徐　靜, 張傳青, 施麗燕, 萬燕杰,

(1. 徐州醫(yī)學(xué)院 江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 徐州, 221002;

2. 上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院 疼痛科, 上海, 200135)

大鼠前扣帶皮層中PSD-95和nNOS在痛情緒中的作用

陳海軍1, 徐靜2, 張傳青2, 施麗燕2, 萬燕杰1,2

(1. 徐州醫(yī)學(xué)院 江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 徐州, 221002;

2. 上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院 疼痛科, 上海, 200135)

摘要:目的探討大鼠前扣帶皮層(ACC)中PSD-95和nNOS 在痛情緒中的作用。方法40只SD大鼠隨機(jī)分為正常組(N組)、F組(福爾馬林)、NS-CPA組(生理鹽水-CPA)、F-CPA組(福爾馬林-CPA)、CCI-CPA組。完成CPA訓(xùn)練后，將各組大鼠麻醉后取ACC，用Western blot方法檢測PSD-95和nNOS蛋白的表達(dá)。結(jié)果與CPA訓(xùn)練前比，F(xiàn)-CPA組和CCI-CPA組大鼠經(jīng)過出現(xiàn)了明顯的回避行為(P<0.05)。與NS-CPA組比較，F(xiàn)-CPA組、CCI-CPA組大鼠ACC中PSD-95、nNOS的表達(dá)上調(diào)(P<0.05), 其中F-CPA組PSD-95的表達(dá)上調(diào)較明顯(P<0.05), 而CCI-CPA組nNOS的表達(dá)上調(diào)更明顯(P<0.05)。結(jié)論 大鼠ACC中PSD-95和nNOS表達(dá)上調(diào)可能參與了痛情緒的形成。

關(guān)鍵詞:前扣帶皮層; 痛情緒; PSD-95; nNOS

疼痛是一種與組織損傷或潛在損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺和情感體驗(yàn)，從定義看它至少包含疼痛感覺(痛感覺)和疼痛情緒(痛情緒)兩個(gè)基本成分。痛感覺主要感受致痛刺激的屬性，包括刺激的性質(zhì)、強(qiáng)度、位置等，也就是人們通常所說的“疼痛”；痛情緒主要涉及傷害性刺激所引起的恐懼、厭惡、焦慮、抑郁等負(fù)性情緒。目前有關(guān)疼痛的研究多集中于痛感覺，而對(duì)于痛情緒的研究不多。事實(shí)上，30%以上的慢性疼痛患者正經(jīng)受著重型抑郁癥的困擾[1]。前扣帶皮層(ACC)是痛情緒形成的一個(gè)關(guān)鍵的部位，其分子基礎(chǔ)可能是NMDA受體[2-5]。近年來研究表明PSD-95 、nNOS參與了痛感覺的中樞敏化過程, PSD-95能夠與NMDA受體、nNOS連接組成信號(hào)復(fù)合物，在介導(dǎo)和整合NMDA受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[6-8], 但PSD-95、nNOS在痛情緒中的作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬在福爾馬林誘導(dǎo)的條件性位置回避模型(F-CPA, 反映痛情緒的模型)大鼠的ACC觀察PSD-95和nNOS的表達(dá)，為痛情緒形成機(jī)制的研究尋找新線索。

1材料與方法

1.1材料

220～280 g的雄性Sprague-Dawley大鼠，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝入水和食物，室溫控制在(22±1) ℃, 24 h晝夜循環(huán)光照。條件性位置回避(CPA)訓(xùn)練裝置(上海欣軟科技有限責(zé)任公司，中國)，鼠抗PSD-95單克隆抗體(1∶1 000, Millipore，USA), 兔抗nNOS單克隆抗體(1∶1 000, CST, USA)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與處理

40只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只: ① 正常組(N組)：不做任何處理; ② 福爾馬林組(F組)：足底注射福爾馬林不進(jìn)行CPA訓(xùn)練; ③ 生理鹽水-CPA組(NS-CPA組)：足底注射生理鹽水且進(jìn)行CPA訓(xùn)練; ④ 福爾馬林-CPA組(F-CPA組)：足底注射福爾馬林且進(jìn)行CPA訓(xùn)練; ⑤ CCI-CPA組：大鼠慢性坐骨神經(jīng)縮窄損傷(CCI, 方法參考文獻(xiàn)[9])14 d后進(jìn)行F-CPA訓(xùn)練。完成CPA訓(xùn)練后各組大鼠用1.5%戊巴比妥鈉(75 mg/kg)腹腔注射后斷頭取ACC, 范圍冠狀面從Bregma向前3.2 mm到1.2 mm, 左右旁開0.8 mm, 深2.6 mm。ACC取出后，稱重，放離心管液氮凍存后-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存，以備Western blot檢測。

1.3行為學(xué)訓(xùn)練

條件性位置回避(CPA)訓(xùn)練裝由兩部分組成: ① 穿梭箱：由3個(gè)不透明的室組成，2個(gè)較大的(30 cm×30 cm×30 cm)為條件訓(xùn)練室(A室、B室)，并排放置。較小的中性室(C室)(15 cm×20 cm×30 cm)位于條件訓(xùn)練室前面。各室之間通過可以移動(dòng)的門(10 cm×10 cm)相通。A室和B室具有不同的特征: A室四壁為黑白相間的縱形條紋，室內(nèi)灑以1%醋酸溶液，底板為粗糙帶孔的塑料薄板; B室四壁為黑白相間的橫形條紋，室內(nèi)灑以1%桂皮水溶液，底板為光滑帶孔的塑料薄板。C室四壁灰色，沒有特殊的條紋，也沒有特殊氣味劑; ② 記錄系統(tǒng)：在A室和B室頂部正中裝有攝像頭，連接計(jì)算機(jī)及顯示器，能夠隨時(shí)觀察大鼠的活動(dòng)，并記錄大鼠在A、B兩室的停留時(shí)間。CPA訓(xùn)練過程參照文獻(xiàn)[10]共4 d。條件訓(xùn)練前：第1天，熟悉環(huán)境，測試大鼠在A室、B室內(nèi)停留時(shí)間，作為基礎(chǔ)值。把大鼠放入C室，適應(yīng)2 min后打開通往A、B兩室的門，當(dāng)進(jìn)入某一室后將門關(guān)閉，讓其在A、B兩室自由穿梭探索15 min, 記錄大鼠在A室、B室中分別的停留時(shí)間。排除標(biāo)準(zhǔn)：在某一室的停留時(shí)間超過總時(shí)間的80%(即720 s)。條件訓(xùn)練：第2天，根據(jù)隨機(jī)原則，將大鼠進(jìn)行平衡。關(guān)閉所有門，將大鼠隨機(jī)放入A室或B室(非福爾馬林匹配室)，停留45 min。第3天，在大鼠一側(cè)后肢足底給予50 μL 5%福爾馬林或生理鹽水(作為對(duì)照)注射后放入另一個(gè)條件室(福爾馬林匹配室)，同樣停留45 min。條件訓(xùn)練后：第4天，測試。測試過程同第1天，記錄大鼠在A室、B室中分別的停留時(shí)間。

1.4Western blot檢測

將每組ACC按1 μL裂解液/100 μg組織的比例加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，勻漿后4 ℃離心30 min, 12 000 r/min, 取適量上清液BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，其余上清液放-80 ℃冰箱中備用。每組取蛋白總量為40 μg的等量樣品，加上樣緩沖液震蕩混勻，在100 ℃沸水中煮5 min。常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后封閉液封閉2h，加一抗PSD-95、nNOS, 4 ℃過夜，TBS緩沖液洗5 min×3次，二抗室溫孵育2 h, 洗膜后ECL法顯色,X線底片曝光。以actin為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1行為學(xué)測試

各組大鼠CPA訓(xùn)練結(jié)果顯示：與CPA訓(xùn)練前比較，NS-CPA組大鼠CPA訓(xùn)練后在匹配室時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), F-CPA組和CCI-CPA組大鼠CPA訓(xùn)練后在匹配室時(shí)間顯著減少，即出現(xiàn)了明顯的回避行為(P<0.05); 與NS-CPA組比較，F(xiàn)-CPA組和CCI-CPA組的大鼠的回避分?jǐn)?shù)(大鼠訓(xùn)練前在匹配室中停留的時(shí)間減去大鼠訓(xùn)練后在匹配室中停留的時(shí)間)顯著增加(P<0.05), 見表1。

組別訓(xùn)練前/s訓(xùn)練后/s回避分?jǐn)?shù)/sNS-CPA467.36±41.26451.96±35.5415.40±35.47F-CPA453.45±48.44172.72±44.28*280.72±42.14#CCI-CPA442.65±35.5573.32±26.13*369.33±39.01#

與訓(xùn)練前比較，*P<0.05; 與NS-CPA組比較，#P<0.05。

2.2Western blot 檢測PSD-95和nNOS的表達(dá)

各組大鼠前扣帶皮層內(nèi)PSD-95和nNOS的表達(dá)結(jié)果顯示: N組、F組、NS-CPA組大鼠ACC中PSD-95、nNOS的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 與NS-CPA組比較, F-CPA組和CCI-CPA組大鼠ACC內(nèi)PSD-95、nNOS的表達(dá)上調(diào)(P<0.05), 與F-CPA組比較, CCI-CPA組大鼠ACC中PSD-95的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，而CCI-CPA組nNOS的表達(dá)上調(diào)(P<0.05),見圖1、2。

3討論

痛情緒是人類的主觀感受，以往缺乏相應(yīng)的動(dòng)物模型，自從Johansen等[4]首次提出反映痛情緒的F-CPA模型后，它已被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物痛情緒機(jī)制的研究。但臨床工作中疼痛病人的情緒變化(厭惡、焦慮、抑郁等)往往是在經(jīng)歷較長一段時(shí)間疼痛折磨之后才會(huì)顯現(xiàn)出來，而且經(jīng)歷病痛的時(shí)間越久出現(xiàn)情緒障礙的概率越高。一份對(duì)494例慢性疼痛患者情緒障礙評(píng)估發(fā)現(xiàn)，其中36.4%表現(xiàn)為抑郁癥，31.4%表現(xiàn)為焦慮，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于急性疼痛人群的患病率[11]。為了與使痛情緒模型更加接近臨床中的真實(shí)情況，本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了CCI-CPA組，即大鼠在坐骨神經(jīng)縮窄損傷建立起神經(jīng)病理性疼痛14 d后再進(jìn)行常規(guī)的F-CPA訓(xùn)練。

圖1 各組大鼠前扣帶皮層(ACC)內(nèi)PSD-95和nNOS的表達(dá)

注:N組、F組、NS-CPA組三組間,#P>0.05;與NS-CPA組比較,◆P<0.05;與F-CPA組比較,*P<0.05。圖2 Westernblot電泳條帶相對(duì)積分光密度值(相對(duì)于正常組)

實(shí)驗(yàn)中各組大鼠在經(jīng)過4 d CPA訓(xùn)練，F(xiàn)-CPA組大鼠出現(xiàn)了明顯的條件性位置回避行為，說明作者成功復(fù)制了F-CPA模型，同時(shí)值得注意的是CCI-CPA組大鼠同樣產(chǎn)生了明顯的條件性位置回避行為。進(jìn)一步的回避分?jǐn)?shù)分析顯示，F(xiàn)-CPA組大鼠的回避分?jǐn)?shù)明顯高于NS-CPA組；與F-CPA組比較，CCI-CPA組大鼠的回避分?jǐn)?shù)則更為明顯。以上結(jié)果說明F-CPA組和CCI-CPA組大鼠都出現(xiàn)了痛情緒反應(yīng)，而經(jīng)歷了14 d坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷后再進(jìn)行CPA訓(xùn)練的CCI-CPA組大鼠表現(xiàn)出更為強(qiáng)烈的痛情緒變化，這種情緒變化更接近于臨床工作中長期慢性疼痛病人所伴有的情緒改變[12-13]。因此，經(jīng)過改良后的CCI-CPA訓(xùn)練過程可能為今后探索建立更為可靠的痛情緒模型提供了線索[14-15]。

痛感覺和痛情緒分別經(jīng)不同的傳導(dǎo)通路上行投射至中樞不同腦區(qū), ACC已被證明是參與痛情緒的高級(jí)中樞[6, 4]在反映痛情緒的F-CPA模型大鼠ACC內(nèi)出現(xiàn)了NMDA受體NR2A和NR2B亞基表達(dá)上調(diào)，而ACC內(nèi)注入NMDA受體拮抗劑可以阻止福爾馬林誘導(dǎo)的條件性位置厭惡情緒的形成，但對(duì)福爾馬林引起的急性疼痛行為反應(yīng)沒有影響，同時(shí)降低痛情緒導(dǎo)致的ACC神經(jīng)元的破壞[5,16], 這些研究表明大鼠ACC內(nèi)NMDA受體的激活參與了痛情緒的形成。近年來研究表明PSD-95、nNOS參與了痛感覺的中樞敏化過程[6-7]。PSD-95作為突觸后致密物中的重要結(jié)構(gòu)蛋白，它一方面和NMDA受體的NR2B亞基緊密相連，同時(shí)也與nNOS的PDZ結(jié)構(gòu)域連接，組成受體-信號(hào)分子-調(diào)節(jié)分子-靶分子復(fù)合物，在介導(dǎo)和整合NMDAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有關(guān)鍵性作用[8]。因此，作者推測ACC中的PSD-95和nNOS可能參與了痛情緒形成[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)中F-CPA組組大鼠產(chǎn)生了強(qiáng)烈的條件性位置回避行為，說明成功復(fù)制了痛情緒模型，同時(shí)觀察到F-CPA組和CCI-CPA組大鼠ACC中PSD-95和nNOS的表達(dá)顯著增加；而只給予痛刺激不進(jìn)行CPA訓(xùn)練(F組)或只進(jìn)行訓(xùn)練不給予痛刺激(NS-CPA組)都沒有引起PSD-95、nNOS的表達(dá)上調(diào)；這些結(jié)果表明，大鼠ACC中PSD-95和nNOS的表達(dá)上調(diào)可能參與了痛情緒的形成。此外，從行為學(xué)結(jié)果看CCI-CPA組大鼠同樣出現(xiàn)了明顯的條件性位置回避行為，即產(chǎn)生了痛情緒。而與F-CPA組比較，CCI-CPA組大鼠ACC中nNOS的表達(dá)增加，PSD-95的表達(dá)雖有下降，但仍高于沒有出現(xiàn)痛情緒反應(yīng)的F組和NS-CPA組，這進(jìn)一步說明大鼠ACC中PSD-95和nNOS的表達(dá)上調(diào)可能參與了痛情緒的形成[19]。

總之，此實(shí)驗(yàn)觀察到在出現(xiàn)痛情緒反應(yīng)的F-CPA和CCI-CPA組大鼠ACC 內(nèi)PSD-95和nNOS表達(dá)顯著上調(diào)，這說明大鼠ACC中PSD-95和nNOS的表達(dá)上調(diào)可能參與了痛情緒的形成，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Role of PSD-95 and nNOS in pain-related aversion

in anterior cingulate cortex of rats

CHEN Haijun1, XU Jing2, ZHANG Chuanqing2, SHI Liyan2, WAN Yanjie1,2

(1.KeyLaboratoryofAnesthesiology,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu, 221002;

2.DepartmentofPain,PudongGongliHospital,Shanghai, 200135)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the role of PSD-95 and nNOS in pain-related aversion in anterior cingulate cortex (ACC) of rats. Methods40 SD rats were randomly divided into group N (normal group), group F (formalin), NS-CPA group (saline-CPA), F-CPA group (formalin-CPA) and CCI-CPA group. After CPA training, the rats were terminally anesthetized and the ACC was rapidly removed, and then the expression of PSD-95 and nNOS in the anterior cingulate cortex were measured by Western blot. ResultsCompared with CPA before training, there was a clear avoidance behavior in the F-CPA group and the CCI-CPA group (P<0.05). Compared with NS-CPA group, the protein expressions of PSD-95 and nNOS were significantly up-regulated in the F-CPA group and the CCI-CPA group (P<0.05), while the PSD-95 was much higher in the F-CPA group(P<0.05), and the nNOS was much higher in the CCI-CPA group(P<0.05). ConclusionUp-regulation of PSD-95 and nNOS in anterior cingulate cortex in rats may be involved in the development of pain-related aversion.

KEYWORDS:anterior cingulate cortex; pain-related aversion; PSD-95; nNOS

通信作者:萬燕杰, E-mail:yanjiewan@sina.com

收稿日期:2014-11-17

中圖分類號(hào):R 338.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)03-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201503001