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不同時(shí)程海洛因依賴大鼠胃竇CD4、CD8和IL-2表達(dá)*

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-03-19網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0959.017.html

夏白娟， 李一欣， 洪艷， 韓晶， 梁文妹

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 探討海洛因依賴期間大鼠胃竇內(nèi)CD4、CD8及白細(xì)胞介素-2(IL-2)的表達(dá)。方法： 正常成年SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NCG)、鹽水對(duì)照組(SCG組)和不同時(shí)程海洛因依賴組(HDG組)；采用免疫組織化學(xué)SABC法及圖像分析法，觀察SCG組和HDG組造模第10、17、24、31及38天時(shí)大鼠胃竇黏膜CD4、CD8和IL-2表達(dá)。結(jié)果： 與NCG組及SCG組比較，HDG組大鼠胃竇CD4、IL-2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，染色變淺，圖像分析的細(xì)胞計(jì)數(shù)和平均灰度值差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HDG組大鼠胃竇CD8陽(yáng)性細(xì)胞較NCG及SCG組細(xì)胞數(shù)量增多，染色變深，在海洛因依賴第24天變化最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 在海洛因依賴期間，CD4、IL-2 在胃竇表達(dá)減弱，CD8表達(dá)增強(qiáng)，提示海洛因依賴對(duì)大鼠胃黏膜免疫功能造成損傷。

[關(guān)鍵詞]CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞； CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞； 白介素2； 胃竇； 海洛因； 大鼠，Sprague Dawley

阿片類物質(zhì)濫用可對(duì)成癮者消化系統(tǒng)造成明顯的損害，引起胃腸蠕動(dòng)減慢、消化道潰瘍及胃腸功能紊亂等癥狀，可能與胃腸道的免疫功能降低有關(guān)[1-3]。T淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫中起著重要作用，主要包括CD4和CD8淋巴細(xì)胞兩大亞群。分布在胃腸黏膜的CD4和CD8淋巴細(xì)胞能保護(hù)黏膜，防御病原菌的入侵。IL-2(interleukin-2)則是由CD4產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，能活化巨噬細(xì)胞，參與免疫防御。課題組前期研究曾報(bào)道過(guò)海洛因戒斷、脫毒和復(fù)吸期間CD4、CD8和IL-2 在大鼠胃竇的表達(dá)變化，但目前對(duì)不同時(shí)程海洛因依賴大鼠胃黏膜免疫功能影響的研究少見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立相關(guān)大鼠模型，觀察不同時(shí)程海洛因依賴期間(10、17、24、31、38 d)，CD4、CD8和IL-2在大鼠胃竇的表達(dá)，探討海洛因依賴期間胃黏膜免疫功能的變化。

1材料與方法

1.1　動(dòng)物分組與試劑

成年雄性(Sprague Dawley，SD)大鼠66只，體質(zhì)量180~220 g，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；按配對(duì)原則隨機(jī)分為正常對(duì)照組(normal control group，NCG)6只，鹽水對(duì)照組(saline control group，SCG)和海洛因依賴組(heroin dependent group, HDG)，各30只。海洛因粉劑，純度61.48%，由貴州省公安廳提供，臨用時(shí)用滅菌注射用水溶解。

1.2　方法

1.2.1海洛因依賴大鼠模型 HDG組按體重逐日遞增皮下注射海洛因藥液，首日劑量為3 mg/kg，2次/日(上午8時(shí)，下午3時(shí))，每日遞增3 mg/kg，連續(xù)注射9 d至成癮，第9天劑量為27 mg/kg。此后每日上午8時(shí)皮下注射海洛因一次，維持至取材，劑量為27 mg/kg。SCG組按體重每日注射HDG組相當(dāng)劑量的生理鹽水。NCG組不予任何處理。

1.2.2標(biāo)本制備HDG組及SCG組分別于第10、17、24、31、38天取材，(分別為HDG10，HDG17，HDG24，HDG31，HDG38和SCG10，SCG17，SCG24，SCG31，SCG38組)每組每次處死6只，NCG組每次處死一只。取胃竇組織，多聚甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm厚的連續(xù)切片。

1.2.3CD4、CD8和IL-2陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)免疫組織化學(xué)SABC法，切片常規(guī)脫蠟脫水，室溫10%甲醇-H2O210 min，正常羊血清(1∶50)室溫下封閉20 min，分別滴加兔CD4、CD8和IL-2抗血清，4 ℃孵育過(guò)夜；羊抗兔 IgG(1∶100)37 ℃孵育20 min，SABC復(fù)合物(1∶100)37 ℃孵育20 min，DAB-H2O2液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片。方法對(duì)照采用PBS緩沖液代替特異性抗血清，其余步驟同上。

1.2.4觀察指標(biāo)隨機(jī)選取HDG組各時(shí)間點(diǎn)和同期SCG組各胃竇切片3例，NCG組3例于40倍物鏡下，每例切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，大鼠胃竇黏膜中CD4陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色之后可見免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，分布于黏膜內(nèi)固有層，胞體小，多呈圓形、橢圓形；CD8陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色之后可見免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色或棕黑色，位于細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，多分布于胃竇黏膜固有層內(nèi)；大鼠胃竇IL-2陽(yáng)性細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色或棕黑色細(xì)顆粒狀，存在于細(xì)胞胞質(zhì)中，陽(yáng)性細(xì)胞多分布于固有層腺底部的結(jié)締組織中。用BioMias圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)CD4、CD8和IL-2陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1　一般情況

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，SCG組和NCG組大鼠皮毛光滑，飲食正常，無(wú)拉稀便等現(xiàn)象，體重逐漸增長(zhǎng)；HDG組大鼠隨海洛因劑量的遞增，從第10天開始出現(xiàn)典型的海洛因依賴癥狀。表現(xiàn)為：給藥后動(dòng)物呆滯、活動(dòng)減少、嗜睡，四肢及軀體肌緊張，尾巴僵直上翹，兩眼凸出、發(fā)亮，眼神迷離無(wú)光彩，用硬物戳之無(wú)反應(yīng)，類似死后僵硬一般，這些表現(xiàn)持續(xù)約30 min；此后開始出現(xiàn)興奮狀態(tài)，表現(xiàn)為活動(dòng)增多，亂竄，快速不停地轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)，舔毛，咬前爪及磕鐵籠等,興奮持續(xù)時(shí)間約90 min。

2.2　CD4、CD8和IL-2表達(dá)

光鏡下， SCG各組和NCG組比較，大鼠胃竇中CD4陽(yáng)性細(xì)胞的分布及免疫染色強(qiáng)度無(wú)明顯差別(圖1-A)；HDG組大鼠胃竇黏膜內(nèi)的CD4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量隨著海洛因依賴時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，且免疫染色強(qiáng)度減弱(圖1-B、圖1-C)。SCG各組大鼠胃竇中CD8陽(yáng)性細(xì)胞的分布及免疫染色強(qiáng)度與NCG組無(wú)明顯差別，HDG大鼠胃竇黏膜內(nèi)CD8陽(yáng)性細(xì)胞在海洛因依賴早期沒有太大變化，于依賴24 d時(shí)數(shù)量明顯增加，免疫染色有所增強(qiáng)(圖1-D、圖1-E)。與NCG組比較，SCG組IL-2陽(yáng)性細(xì)胞的分布及免疫反應(yīng)染色強(qiáng)度均無(wú)明顯變化，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，該兩組平均灰度值無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖1-F)。海洛因依賴大鼠組胃竇IL-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少(圖1-G、圖1-H)。

A~C為SCG10、HDG31及HDG38組 CD4陽(yáng)性細(xì)胞，D~E為HDG24及HDG38組 CD8陽(yáng)性細(xì)胞；F~H為SCG31、HDG17及HDG24 IL-2陽(yáng)性細(xì)胞圖1　各組大鼠胃竇CD4、CD8、IL-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞(SABC×400)Fig.1　The CD4, CD8 and IL-2 positive cells in gastric antrum of rats in each group

2.3　CD4、CD8和IL-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量

大鼠胃竇黏膜CD4、CD8和IL-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在NCG與SCG各組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HDG組CD4和IL-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，與NCG、SCG比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著依賴時(shí)間的延長(zhǎng)兩種細(xì)胞減少的趨勢(shì)越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HDG組CD8陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在海洛因依賴的第10、17天時(shí)無(wú)明顯變化，在第24天時(shí)升高(P<0.05)，此后數(shù)量雖有所升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且CD4/CD8的比值明顯<1。見表1。

表1　各組大鼠胃竇黏膜中CD4、CD8、IL-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量

2.4　CD4、CD8和IL-2陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值

CD4、IL-2陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值在NCG和SCG各組分別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； CD4陽(yáng)性細(xì)胞和IL-2陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值在HDG組隨著海洛因依賴時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，CD4差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而IL-2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HDG組CD8陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值在海洛因依賴第24天之后較NCG和SCG各組和HDG1、HDG2組顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

(1)與本組內(nèi)NCG、SCG各組比較P<0.05圖2　各組大鼠胃竇黏膜中CD4、CD8、IL-2陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值Fig.2　The average gray degree of CD4, CD8 and IL-2 positive cells in gastric antrum of rats in each group

3討論

CD4淋巴細(xì)胞和CD8淋巴細(xì)胞參與了機(jī)體病毒免疫、抗腫瘤免疫等作用，在正常人體內(nèi)的比例約為2[7-8]。CD4是輔助性T細(xì)胞的表面標(biāo)志，CD8是殺傷性T細(xì)胞的表面標(biāo)志。在免疫應(yīng)答過(guò)程中，CD8+T細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用，特異性直接殺傷靶細(xì)胞；CD4+T細(xì)胞具有協(xié)助體液免疫和細(xì)胞免疫的功能。兩者既相互聯(lián)系、相互促進(jìn)，又相互制約。其中任何一方異常、免疫調(diào)節(jié)失衡，即可出現(xiàn)病理狀態(tài)。

研究發(fā)現(xiàn)阿片類物質(zhì)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有抑制作用[10]。對(duì)海洛因依賴患者外周血的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，CD4淋巴細(xì)胞數(shù)較正常值降低，CD4/CD8的比值<1[11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果CD4淋巴細(xì)胞數(shù)隨著海洛因依賴天數(shù)的增加而逐漸減少，免疫染色變淺，表明海洛因能加速CD4淋巴細(xì)胞凋亡使細(xì)胞數(shù)量減少，與Yin等[13]報(bào)道相符。CD8淋巴細(xì)胞數(shù)及免疫染色強(qiáng)度在海洛因依賴初期變化不明顯，從第24天起細(xì)胞數(shù)增多，免疫染色逐漸加深，推測(cè)可能與CD8 淋巴細(xì)胞具有抑制T 細(xì)胞活性，對(duì)免疫應(yīng)答有負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)有關(guān)，CD4/CD8比值的降低也提示胃黏膜免疫防御功能下降[14]。本實(shí)驗(yàn)中，海洛因依賴大鼠胃竇IL-2細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)減少，免疫反應(yīng)強(qiáng)度減弱，與Li HY等[15]的報(bào)道相符，表明CD4淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-2的能力減弱。而IL-2能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，IL-2分泌的減少，對(duì)CD4淋巴細(xì)胞的增殖造成了影響[16]。在海洛因依賴期間，胃竇黏膜免疫功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，這也是海洛因?yàn)E用者容易受病毒、細(xì)菌感染而出現(xiàn)相關(guān)臨床并發(fā)癥的原因之一。

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(2015-01-07收稿，2015-02-23修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 周凌

The Expression of CD4, CD8 and IL-2 in Gastric Antrum of

Heroin-dependent Rats in Different Periods

XIA Baijuan, LI Yixin, HONG Yan, HAN Jing, LIANG Wenmei

(DepartmentofHistologyandEmbryology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the expression of CD4, CD8 and interleukin-2 (IL-2) in gastric antrum of heroin-dependent rats. Methods: Adult SD rats were divided into normal control group (NCG)，saline control group (SCG) and heroin-dependent group (HDG). Immunohistochemical SABC method and imagine analysis technique were performed to detect the expression of CD4、CD8 and IL-2 in the 10th,17th,24th,31stday after establishing heroin-dependent model.Results: The number of CD4, IL-2 positive cells and intensity of immunohistochemical staining of CD4, IL-2 in HDG were decreased, compard with NCG and SCG. The results of imagine analysis showed that the difference of the number and the average gray degree of CD4, IL-2 were statistically significant(P<0.05).Compared with NCG and SCG, the intensity of immunohistochemical staining and the number of CD8 positive cells in gastric antrum in HDG increased, the most obvious change appeared at 24thday of heroin dependence. Conclusions: The expression of CD4, IL-2 in gastric antrum is distinctly reduced, that of CD8 enhance during heroin dependence, suggesting that the immune function of rat antrum is damaged by heroin.

[Key words]CD4 positive T Cells； CD8 positive T Cells； interleukin-2； gastric antrum； heroin; rats,Sprague-Dawley

[中圖分類號(hào)]R329.44； R34-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)03-0241-04

[基金項(xiàng)目]*貴州省衛(wèi)生廳優(yōu)秀青年基金(No：G2009-11)；貴州省科技廳基金[黔科合J字2010(2153)]