胡桂萍， 葉武光， 石旭平， 張國(guó)彪， 賀望興， 游艷紅， 朱運(yùn)華

(江西省蠶桑茶葉研究所， 江西 南昌 330202)

茶葉聯(lián)苯菊酯殘留降解菌的篩選與鑒定

胡桂萍， 葉武光， 石旭平， 張國(guó)彪， 賀望興， 游艷紅， 朱運(yùn)華

(江西省蠶桑茶葉研究所， 江西 南昌 330202)

摘要:以茶園常超標(biāo)農(nóng)藥聯(lián)苯菊酯為降解對(duì)象，采用生物富集、農(nóng)藥馴化等方式從茶園土壤中篩選出高效降解菌LB-1。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹等方法，初步鑒定該菌株為克雷伯氏菌Klebsiella sp.。菌株LB-1在MSM培養(yǎng)基中呈S型生長(zhǎng)，且能以聯(lián)苯菊酯為唯一碳源，對(duì)聯(lián)苯菊酯顯示很強(qiáng)的降解潛能，有望為開發(fā)安全、環(huán)保的茶葉農(nóng)藥降污劑提供重要的菌株來(lái)源，也為其他果蔬農(nóng)藥降污提供理論支持和技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞:茶園； 微生物降解； 聯(lián)苯菊酯； Klebsiella sp.

茶葉是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，2012年我國(guó)茶葉產(chǎn)量居世界第一，出口量居世界第二。隨著生活水平的提高，人們對(duì)茶葉食品安全問題越來(lái)越重視(戴平望，2014)。調(diào)查顯示農(nóng)藥殘留超標(biāo)成為當(dāng)前我國(guó)茶葉出口和內(nèi)銷重要瓶頸。茶葉上常殘留和常超標(biāo)農(nóng)藥有數(shù)十種，其中聯(lián)苯菊酯為茶葉農(nóng)藥超標(biāo)目錄上頻率高的農(nóng)藥種類之一。聯(lián)苯菊酯為一種人工合成的菊酯類超高效殺蟲劑，對(duì)茶尺蠖等鱗翅目食葉幼蟲、茶蚜、小綠葉蟬、茶葉象甲、茶葉螨類等茶樹主要害蟲具有很強(qiáng)的觸殺和胃毒作用，其綜合防治害蟲效果要優(yōu)于其他農(nóng)藥，為茶園首選擬除蟲菊酯類農(nóng)藥品種(陳宗懋，2002)，但是長(zhǎng)期的噴灑，加上聯(lián)苯菊酯化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定在環(huán)境中不易分解等特點(diǎn)(Laskowski,2002)，且農(nóng)藥被農(nóng)作物利用率低，導(dǎo)致茶園和茶葉上聯(lián)苯菊酯殘留超標(biāo)，嚴(yán)重影響茶葉品質(zhì)，同時(shí)也嚴(yán)重危害到人類的健康和生態(tài)環(huán)境安全。2000年7月1日歐盟(EU)對(duì)外宣布開始對(duì)茶葉的農(nóng)藥最高殘留量(MRL)執(zhí)行新標(biāo)準(zhǔn)，聯(lián)苯菊酯的限量一度從5.0 mg聯(lián)苯菊酯的降到0．1mg聯(lián)苯，使我國(guó)茶葉出口面臨著更為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)(陳宗懋，2001)。因此，茶葉農(nóng)藥殘留問題已成為亟待解決的問題。

自然環(huán)境中農(nóng)藥主要是依靠生物和非生物2種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥的降解和轉(zhuǎn)化(喬雄梧，1999)，相對(duì)于物理、化學(xué)降解方法，微生物降解農(nóng)殘因具有安全、綠色、高效和無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，被眾多學(xué)者認(rèn)為是處理農(nóng)藥污染的一種新型有效的方法(王兆守和李順鵬，2005)，目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)主要集中在從自然環(huán)境中分離和篩選出能高效降解農(nóng)藥的微生物，對(duì)微生物降解機(jī)理以及對(duì)微生物降解菌進(jìn)行改造研究(王偉東等，2005)。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的聯(lián)苯菊酯可以通過(guò)微生物自身酶系統(tǒng)以及分泌的代謝物作用被分解(Singh,2009；Leeetal.,2004)，羅天雄(2009)發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯菊酯可能是被降解微生物作為有機(jī)碳源而降解且聯(lián)苯菊酯濃度越高，微生物生長(zhǎng)越好。因此土壤微生物在聯(lián)苯菊酯的降解過(guò)程中發(fā)揮著重要作用(Zhangetal.,2005;Sogorbetal.,2002;Yuetal.,2003)。但目前已報(bào)道的降解微生物均屬于異位修復(fù)，異位修復(fù)存在與本地微生態(tài)環(huán)境不兼容等問題，加之微生物修復(fù)受環(huán)境影響大且修復(fù)效果不穩(wěn)定，因此對(duì)于可有效降解茶葉上聯(lián)苯菊酯的微生物還鮮見報(bào)道。本研究擬從茶園土壤出發(fā)，篩選出可降解聯(lián)苯菊酯的微生物BCL-1，并對(duì)其進(jìn)行生理生化、16S rRNA和構(gòu)建進(jìn)化樹鑒定分析，以期為我國(guó)生態(tài)綠色茶園的建設(shè)、茶葉農(nóng)藥降污劑的開發(fā)和提升茶葉品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1培養(yǎng)基

電富集培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，酵母提取物5，磷酸氫二鉀1，葡萄糖1，pH 7.0-7.2。LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15，pH 7.0-7.2。基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基MSM(g/L)：磷酸氫二納1.5，磷酸二氫鉀1.5，硝酸四氫氮1，硫酸鎂0.2，氯化鈣0.01，硫酸鎂0.001，酵母提取物0.05，pH 7.0-7.2。

分離培養(yǎng)基：在MSM培養(yǎng)基中加入聯(lián)苯菊酯乳油使培養(yǎng)基中聯(lián)苯菊酯的終濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1供試土壤的馴化將土壤編號(hào)1、2、3、4、5、6的土壤按1:1:1:1:1:1的比例混合，分裝到6個(gè)花盆里，每天澆灌適量聯(lián)苯菊酯乳油稀釋液，保持土壤濕潤(rùn)，第一個(gè)月澆灌的聯(lián)苯菊酯乳油稀釋液濃度為100 mg/L,每個(gè)月以50 mg/L的濃度增幅依次遞增，澆灌馴化12個(gè)月，即為土樣馴化。

1.2.2聯(lián)苯菊酯降解菌系的富集及降解菌株LB-1的分離、純化富集培養(yǎng)：分別取7號(hào)樣品污泥和馴化土樣5 g到100 mL含聯(lián)苯菊酯50 mg/L的富集培養(yǎng)基中，30 ℃，170 r/min震蕩培養(yǎng)7 d。

馴化培養(yǎng)：吸取富集培養(yǎng)液10 mL轉(zhuǎn)接到100 mL含有100 mg/L的聯(lián)苯菊酯的MSM培養(yǎng)基中，30 ℃，170 r/min震蕩培養(yǎng)7 d。取10 mL培養(yǎng)液接入到濃度為200 mg/L的聯(lián)苯菊酯的MSM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)方法同上，震蕩培養(yǎng)7 d，用同樣的培養(yǎng)方法，以100 mg/L的濃度增幅依次提高M(jìn)SM培養(yǎng)基中聯(lián)苯菊酯的濃度至1000 mg/L。

分離純化：將最終馴化得到的培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)梯度稀釋后涂布在含有100 mg/L聯(lián)苯菊酯的MSM培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度(10-1、10-2、10-3、10-4)涂布三塊平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。挑取生長(zhǎng)旺盛的單菌落進(jìn)行反復(fù)劃線純化，將純化后的菌株保存在含有15%甘油和100 mg/L聯(lián)苯菊酯的LB培養(yǎng)基中，編號(hào)，于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

LB-1降解菌的篩選：實(shí)驗(yàn)共獲得4株對(duì)聯(lián)苯菊酯有降解效能的菌株，其中菌株LB-1可在3 d內(nèi)對(duì)50 mg/mL聯(lián)苯菊酯的降解效能達(dá)到92.4%，該部分將另文發(fā)表。

1.2.3 菌株的鑒定形態(tài)學(xué)觀察:將分離純化得到的降解菌采用平板劃線法接種到固體LB培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)16 h后觀察菌落形態(tài)。

生理生化反應(yīng):用接種環(huán)從平板上挑取已分離的單一菌落分別接種到生化反應(yīng)安培瓶(北京陸橋技術(shù)有限公司)中，置適宜溫度下培養(yǎng)，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。透射電鏡觀察,具體如下:

①在液體LB培養(yǎng)基上以30 ℃，180 r/min條件過(guò)夜培養(yǎng)降解菌；

②將膜銅網(wǎng)附在菌懸液上1 min，取出，放在濾紙片上自然風(fēng)干；

③將附有細(xì)菌的膜銅網(wǎng)在pH 6.8的2%磷鉬酸液滴上染色1-2 min，放在濾紙片上自然風(fēng)干，于透射電鏡下觀察。

1.2.4LB-1菌生長(zhǎng)曲線分析用接種環(huán)取一環(huán)經(jīng)過(guò)平板活化的LB-1菌至MSM液體培養(yǎng)基中，在30 ℃，170 r/min的條件下每隔2 h取一次菌液，菌液在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度值(OD)，繪制LB-1菌的生長(zhǎng)曲線。

1.2.5LB-1菌系統(tǒng)發(fā)育分析(1)菌株總DNA的提取:菌株總DNA的提取方法參照南春燕(2013)的方法，具體如下：

①取1 mL菌液，8000 g，離心2 min，棄上清，加400 μL提取緩沖液沖洗細(xì)胞2次，8000 g，離心2 min，棄上清。

②用200 mL TE buffer懸浮菌體，加入100 μL的Tris 飽和酚(pH 8.0)，渦旋混合1 min。

③13000 rpm/min，離心5 min，取上清。

④加入40 μL TE buffer和100 μL氯仿，混合震蕩，13000 rpm/min，離心5 min。

⑤取160 μL上清液，加入40 μL TE buffer和5 μL RNase(10 mg/mL)，37 ℃放置10 min。

(2)菌株16S rDNA擴(kuò)增

引物序列：P0：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'； P6：5'-CATCGGCTACCTTGTTACGA-3'

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：細(xì)菌總DNA模板(約100ng/μL)1 μL，Taq PCR Mix 12.5 L(2x)12.5 μL，引物 P0(10R Mix 12.5 L(2x)) 1 μL，引物 P6(10R Mix 12.5 L(2x)) 1 μL，去離子水9.5 μL

PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物送往上海生工生物公司測(cè)序。

(3)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測(cè)序結(jié)果序列提交GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載相似度大于95%的模式菌株的序列，以fasta格式整合到一個(gè)文件內(nèi)，啟動(dòng)MEGA 5.0軟件，將得到的整合文件導(dǎo)入到MEGA軟件，序列全選，用Align by Clustal W進(jìn)行多重序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)束后，選擇菜單欄中Analysis選項(xiàng)中的 phylogeny Construct/Test Neighbor Joining Tree選項(xiàng)進(jìn)行序列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，然后計(jì)算分枝間的遺傳距離。Boostrap值設(shè)置為1000來(lái)分析分支系統(tǒng)發(fā)育樹各分支聚類的穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

2.1聯(lián)苯菊酯降解菌LB-1的形態(tài)特征

經(jīng)過(guò)連續(xù)12個(gè)月的土壤菌株馴化培養(yǎng)，再通過(guò)平板劃線分離技術(shù)，得到一株以聯(lián)苯菊酯為唯一碳源的菌株，將其命名為L(zhǎng)B-1，該菌株菌落光滑，呈白色半透明狀，直徑2-3 nm。電鏡下觀察得到，聯(lián)苯菊酯降解菌LB-1橢圓狀桿菌，大小約為2圓狀桿無(wú)芽孢、鞭毛狀結(jié)構(gòu)，有較厚的莢膜(圖1)。

圖1菌株LB-1電鏡圖 圖2菌株LB-1的16S rDNA電泳圖

Figure 1Strain LB-1 by scanning Figure 2Electrophoretogram picture of

electron microscope (SEM) 16S rDNA on strain LB-1

1.LB-1; 2.Mark

2.2聯(lián)苯菊酯降解菌的鑒定

提取菌株LB-1的總DNA，并進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，電泳得到1400 bp片段(圖 2)，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI比對(duì)得到，該菌株率屬于克雷伯氏菌屬，與Klebsiella variicola的序列匹配度達(dá)到99.9%。對(duì)該菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得到(圖3)，LB-1與6株克雷伯氏菌模式菌株形成3個(gè)不同的分支，表明這些菌株屬于3個(gè)不同的亞群，但與美國(guó)變棲克雷伯氏菌KlebsiellavariicolaAt-22親緣關(guān)系最近。因此根據(jù)16S rDNA鑒定以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，聯(lián)苯菊酯降解株LB-1被鑒定為克雷伯氏菌。

2.3聯(lián)苯菊酯降解菌LB-1的生理生化特性

聯(lián)苯菊酯降解菌LB-1為革蘭氏陰性菌，其生理生化特性如圖4所示，硫化氫反應(yīng)、硝酸鹽反應(yīng)、NaCl-蛋白胨反應(yīng)呈陰性，但尿素酶、42 ℃生長(zhǎng)反應(yīng)呈陽(yáng)性；LB-1菌能利用阿拉伯糖產(chǎn)酸。

圖3聯(lián)苯菊酯降解菌LB-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Figure 3Phylogenetic tree of bifenthrin-degrading strain LB-1

圖4菌株LB-1生理生化鑒定

Figure 4Physiology and biochemistry identification of strain LB-1

2.4菌株LB-1生長(zhǎng)曲線

如圖5所示，菌株LB-1在發(fā)酵培養(yǎng)初期(0-2 h)生長(zhǎng)緩慢，主要原因是細(xì)菌必須在適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境以及為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的快速繁殖合成必要的前體物質(zhì)，在2-16 h培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，該期間菌株LB-1快速繁殖，菌濃度越來(lái)越高；培養(yǎng)16 h之后菌株進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，菌株生長(zhǎng)量與死亡量相平衡，菌濃度變化不大；在培養(yǎng)20 h后由于培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡以及有害次生代謝產(chǎn)物的積累導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)量低于死亡量，細(xì)菌進(jìn)入衰亡期。

圖5　菌株LB-1生長(zhǎng)曲線

3討論

國(guó)內(nèi)外已有大量有關(guān)菊酯類農(nóng)藥降解菌的報(bào)道，近幾年對(duì)聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥降解菌的報(bào)道也越來(lái)越多(王兆守等，2003)，但截止目前，除綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa(張建云等，2010)外，已報(bào)道的菊酯類農(nóng)藥降解菌主要集中在真菌(Saikia and Gopal,2004)、綠色木霉Trichodermaviride(Liang et al.,2005)、曲霉屬AspergillusnigerZD11(李松檜和李日強(qiáng)，2008)等。張建云等(2010)報(bào)道綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaGZ-3在37 ℃和220 r/min培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72 h后對(duì)初始濃度為50 mg/L的氟氯氰菊酯的降解效率可達(dá)80%以上。T.Viride 5-2, T.Viride 2211,Aspergillusniger,A.terricola, 和Phanerochaetechrysoporium在28 ℃下培養(yǎng)20 d后對(duì)初始濃度為5 mg/mL的氟氯氰菊酯的降解效率分別達(dá)80%，62%，30%，30%和60%左右。但有關(guān)克雷伯氏菌屬農(nóng)藥降解菌的報(bào)道還沒有見到，本實(shí)驗(yàn)從農(nóng)藥馴化土壤中分離篩選出一株潛在的降解聯(lián)苯菊酯的菌株LB-1，通過(guò)形態(tài)學(xué)，生理生化特性，16S rDNA初步鑒定為克雷伯氏菌。菌株LB-1的分離豐富了菊酯類農(nóng)藥降解菌資源，在被污染的土壤和污水等環(huán)境的生物修復(fù)中具有很大的應(yīng)用潛力。但降解菌對(duì)于農(nóng)藥的降解一般都是通過(guò)共代謝或者礦化方式進(jìn)行。降解過(guò)程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物有可能次生代謝物的毒性高于本體而存在環(huán)境安全性問題，如Khanetal(1988)分離到一株溴氰菊酯降解菌，降解效果不佳，不能完全徹底降解溴氰菊酯。主要是溴氰菊酯降解會(huì)產(chǎn)生另一種對(duì)水體等有毒的物質(zhì)間苯氧基苯甲醛(3-PhenoxyBenzalde-hyde)。因此筆者認(rèn)為除了加強(qiáng)對(duì)原位修復(fù)微生物資源的開發(fā)和挖掘外，解決菌株室外降解效能與自然環(huán)境中惡劣且復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境和農(nóng)藥處理負(fù)荷存在差距的問題，還要加強(qiáng)對(duì)農(nóng)藥降解的中間產(chǎn)物和進(jìn)一步降解的途徑研究，從而更全面對(duì)降解菌環(huán)境安全性的進(jìn)行評(píng)價(jià)，以便更有助于降解菌產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用。

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(責(zé)任編輯：陳曉雯)

胡桂萍，葉武光，石旭平，張國(guó)彪，賀望興，游艷紅，朱運(yùn)華.2015.茶葉聯(lián)苯菊酯殘留降解菌的篩選與鑒定.武夷科學(xué)，31：147-153.

Isolation and identification of degrading bacteria against tea bifenthrin residue

Gui-Ping HU, Wu-Guang YE, Xu-Ping SHI, Guo-Biao ZHANG,

Wang-Xing HE, Ye-Hong YOU, Yun-Hua ZHU

(JiangxiSericultureandTeaResearchInstitute,Nanchang,Jiangxi330202,China)

Abstract:One strain LB-1 was isolated from the soil in tea plantations by bio-enrichment and pesticide acclimatization, for degrading bifenthrin that was often in excess of maximum residue limit (MRL) in tea plantations. Strain LB-1 was identified as Klebsiella sp. using the morphological, physiological and 16S rDNA sequence analysis. The strain LB-1 showed S growth in minimum salts medium (MSM) with strong potential for the degradation of bifenthrin and could provide important sources for the developing safe and green degrader of tea, and also provide theoretical support and technical reference for pesticide degrader of other fruits and vegetables.

Key words:tea plantation; microbial degradation; bifenthrin; Klebsiella sp.

中圖分類號(hào):X592; X172

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1001-4276-(2015)01-0147-07

通訊作者：胡桂萍(1985-),女，博士。研究方向：茶葉病蟲害和農(nóng)藥殘留微生物降解技術(shù)。email：hugp2007@163.com。

基金項(xiàng)目：科技支撐計(jì)劃(20151BBA13042)、公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303094-08)。

收稿日期：2015-10-12; 發(fā)表日期：2015-10-31