何家全 楊忠 蔡文琴

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院神經(jīng)外科， 四川 南充 637000; 2.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部組織胚胎學(xué)教研室， 重慶 400038)

不同發(fā)育階段視神經(jīng)移植物對(duì)橫斷成年大鼠視神經(jīng)再生修復(fù)的影響*

何家全1楊忠2蔡文琴2

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院神經(jīng)外科， 四川 南充 637000; 2.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部組織胚胎學(xué)教研室， 重慶 400038)

目的 觀察不同發(fā)育階段大鼠視神經(jīng)移植物對(duì)成年大鼠中樞神經(jīng)損傷再生的影響。方法 將不同發(fā)育階段的視神經(jīng)移植到成年大鼠視神經(jīng)的斷端，并與其自身的坐骨神經(jīng)移植物作對(duì)照，運(yùn)用HE染色、鍍銀染色及神經(jīng)示蹤等方法觀察不同發(fā)育階段大鼠的視神經(jīng)移植物對(duì)成年大鼠橫斷視神經(jīng)修復(fù)的影響。結(jié)果 胚胎18天大鼠視神經(jīng)移植物與坐骨神經(jīng)移植物一樣，在移植到成年大鼠視神經(jīng)后20天，有大量的軸突穿過(guò)了移植區(qū)，經(jīng)HRP傷側(cè)眼球內(nèi)注射順行示蹤顯示，在視神經(jīng)到達(dá)的靶區(qū)上丘出現(xiàn)了陽(yáng)性標(biāo)記的神經(jīng)元，但這種現(xiàn)象在出生后大鼠視神經(jīng)移植物的移植后從未見(jiàn)到，但如果移植物愈早，那么成年大鼠視神經(jīng)近側(cè)斷端長(zhǎng)出的纖維就愈多愈長(zhǎng)。結(jié)論 在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的膜上可能存在著抑制神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的物質(zhì)，這些物質(zhì)可抑制損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)纖維的再生延長(zhǎng)及功能重建。

視神經(jīng)； 移植； 中樞神經(jīng)系統(tǒng)； 損傷再生

離體研究顯示，成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞具有抑制神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的特性，那么在體的情況又如何呢？我們的研究發(fā)現(xiàn)，隨著大鼠視神經(jīng)不斷發(fā)育成熟，視神經(jīng)內(nèi)成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量也不斷增加。視神經(jīng)為中樞神經(jīng)。因此，我們?cè)诮⒊赡甏笫笠暽窠?jīng)橫斷損傷模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)將不同發(fā)育階段的視神經(jīng)移植到成年大鼠視神經(jīng)的斷端，并以其自身的坐骨神經(jīng)移植作對(duì)照，運(yùn)用形態(tài)學(xué)及神經(jīng)示蹤等方法，觀測(cè)橫斷成年大鼠視神經(jīng)的再生修復(fù)情況，從一個(gè)側(cè)面探討少突膠質(zhì)細(xì)胞在自體情況下對(duì)損傷神經(jīng)元軸突再生的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只雄性成年Wistar大鼠，清潔2級(jí)，體重230～250克，平均分成10組，每組4只，分別用于E18、P0、P3、P5、P8、P15、P20、P90天大鼠視神經(jīng)移植及坐骨神經(jīng)移植和正常對(duì)照。每組用兩只不同發(fā)育階段的大鼠作為移植視神經(jīng)的供體。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 成年大鼠一側(cè)視神經(jīng)橫斷移植模型的制作 本模型的制作采用Hausmann等[1]的方法進(jìn)行，具體操作步驟如下：成年大鼠用0.5%戊巴比妥鈉按40mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于解剖板上,頭皮剪毛后常規(guī)消毒鋪巾,矢狀位正中切開(kāi)頭皮。小心打開(kāi)眶板，分離視神經(jīng)。解剖顯微鏡下在球后約2mm處向后縱行切開(kāi)視神經(jīng)鞘，長(zhǎng)約3mm，在鞘內(nèi)將視神經(jīng)橫斷，并剪切除約1～2mm長(zhǎng)一段視神經(jīng)，此步驟視移植物而定，如移植胚胎及發(fā)育早期的視神經(jīng)時(shí)可只作切斷，而不切除，因?yàn)榍袛嗟囊暽窠?jīng)有一定程度的收縮。將預(yù)先準(zhǔn)備好的移植物縱行放置于視神經(jīng)鞘內(nèi)，斷端互相接觸。鞘切口處用小塊明膠海綿覆蓋，連續(xù)縫合頭皮,清醒后自由喂養(yǎng)。對(duì)照組僅作視神經(jīng)切斷，止血后即縫合頭皮。

1.2.2 移植物的準(zhǔn)備 不同發(fā)育階段的大鼠碘伏消毒后直接斷頭處死，在解剖顯微鏡下快速分離出視神經(jīng)，并放入含0.6%葡萄糖的滅菌生理鹽水中備用。成年(P90d)視神經(jīng)移植物供體大鼠在斷頭取視神經(jīng)前先于其雙股后部消毒后切取坐骨神經(jīng)。

1.2.3 順行軸突追蹤 成功模型動(dòng)物用示蹤劑HRP進(jìn)行順行示蹤。具體步驟如下：動(dòng)物存活18天后，用0.5%戊巴比妥鈉麻醉，用微量進(jìn)樣器于移植側(cè)眼球內(nèi)注入HRP 10μl，HRP用2%的DSMO配制。留針5分鐘后拔針，并用小紗布?jí)K壓迫眼球30秒鐘以防示蹤劑滲漏，動(dòng)物清醒后自由喂養(yǎng)。

1.2.4 取材固定及切片 注入示蹤劑后48小時(shí)，常規(guī)麻醉，開(kāi)胸，經(jīng)左心室主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)右心耳，首先灌入200ml肝素化的PBS，隨后灌入250ml 1%多聚甲醛、2%戊二醛、0.1M PBS(pH7.4)。灌流后的大鼠在4℃冰箱中放置3～4小時(shí)后取出全腦及移植側(cè)視神經(jīng)，在相應(yīng)固定液中固定6小時(shí)，再轉(zhuǎn)入25%蔗糖、4%多聚甲醛中浸糖脫水,直至組織下沉至瓶底。行全腦冠狀切片及視神經(jīng)縱行恒冷冰凍切片，片厚為20μm，腦片切下后再入上述固定液中保存?zhèn)溆茫暽窠?jīng)切片則貼在預(yù)先包被APES的載玻片上，用于組織化學(xué)染色。

1.2.5 組織化學(xué)染色 HE染色及HRP示蹤顯色按常規(guī)進(jìn)行。

1.2.6 視神經(jīng)軸突鍍銀染色 采用易家農(nóng)(1986)著《組織學(xué)與組織學(xué)技術(shù)》中介紹的方法。本染色結(jié)果新生軸突呈黑色，由于采用灌注軀血固定，背景清晰，對(duì)比鮮明。另外，不使用高價(jià)的硝酸鈾而直接入氨銀液，染色全過(guò)程只需40分鐘左右即可完成，方法較簡(jiǎn)便。

2 結(jié)果

2.1 非移植對(duì)照大鼠橫斷視神經(jīng)軸突的反應(yīng) 在非移植對(duì)照組，解剖標(biāo)本肉眼可見(jiàn)遠(yuǎn)側(cè)斷端(腦端)較近側(cè)端(眼球端)明顯變細(xì)；HE染色可見(jiàn)視神經(jīng)斷端鈍園，為結(jié)締組織所包繞(圖1)；鍍銀染色可見(jiàn)斷端只有少量流產(chǎn)再生的軸突(圖2)；HRP示蹤在整個(gè)腦組織內(nèi)亦未見(jiàn)有HRP陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞。

圖1 HE染色非移植組，斷端視神經(jīng)被結(jié)締組織包繞 ×200

Figure 1 The optic nerve surrounded by connective tissue on the broken stump in nonimplantation group (HE staining, ×200)

圖2 鍍銀染色非移植組，視神經(jīng)斷端有少許再生軸突 ×200

Figure 2 The few regenerated axon on the broken stump in nonimplantation group (silver staining, ×200)

2.2 坐骨神經(jīng)移植對(duì)照大鼠的反應(yīng) 在坐骨神經(jīng)移植組，無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)的兩視神經(jīng)斷端直徑的變化，HE染色在遠(yuǎn)近端橫切面上無(wú)明顯的不同；鍍銀染色可見(jiàn)兩斷端間有大量再生的無(wú)髓神經(jīng)纖維(圖3)，HRP示蹤可見(jiàn)在上丘部出現(xiàn)了陽(yáng)性標(biāo)記的神經(jīng)元(圖4)。

2.3 不同發(fā)育階段視神經(jīng)移植對(duì)橫斷視神經(jīng)的影響 在本文視神經(jīng)移植組大鼠均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的兩斷端視神經(jīng)直徑的改變。胎鼠視神經(jīng)移植組可見(jiàn)兩斷端之間形成了瘢痕組織(圖5)，但瘢痕組織中可見(jiàn)較多新生無(wú)髓軸突通過(guò)(圖6)，HRP示蹤亦可見(jiàn)在上丘部有較多陽(yáng)性標(biāo)記的神經(jīng)元(圖7、8)；在P0天視神經(jīng)移植組中，雖可見(jiàn)較多生長(zhǎng)較長(zhǎng)的新生無(wú)髓鞘軸突(圖9)，但HRP示蹤始終未見(jiàn)腦區(qū)內(nèi)有陽(yáng)性標(biāo)記的神經(jīng)元；在P3天視神經(jīng)移植組中，可見(jiàn)斷端間新生的軸突較P0天明顯減少，且其排列方向較雜亂(圖10)；到P15天視神經(jīng)移植組，只見(jiàn)視神經(jīng)斷端有少許雜亂生長(zhǎng)的軸突。P0天以后視神經(jīng)移植組中，各腦區(qū)內(nèi)均未見(jiàn)HRP陽(yáng)性標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞。

圖3 鍍銀染色坐骨神經(jīng)移植組，斷端可見(jiàn)大量再生軸突 ×200

Figure 3 The large regenerated axon on the broken stump in implantation group (silver staining, ×200)

圖4 HRP示蹤坐骨神經(jīng)移植組，視神經(jīng)靶區(qū)上丘出現(xiàn)了陽(yáng)性標(biāo)記神經(jīng)元 ×400

Figure 4 The positive neuron with HRP tracing in implantation group (×400)

圖5 HE染色胎鼠視神經(jīng)移植組，斷端視神經(jīng)出現(xiàn)瘢痕組織 ×100

Figure 5 The scar tissue on broken stump of optic nerve in implantation group

圖6 鍍銀染色胎鼠視神經(jīng)移植組，斷端視神經(jīng)間有大量再生的神經(jīng)纖維通過(guò) ×200

Figure 6 The regenerative nerve fibers at broken stump of optic nerve in implantation group

圖7 HRP軸突示蹤胎鼠視神經(jīng)移植組，示蹤劑到達(dá)靶區(qū)上丘 ×40

Figure 7 The tracer in superior colliculus in implantation group (×40)

圖8 HRP軸突示蹤胎鼠視神經(jīng)移植組，示蹤劑到達(dá)靶區(qū)上丘×400

Figure 8 The tracer in superior colliculus in implantation group (×400)

圖9 鍍銀染色新生大鼠視神經(jīng)移植組，斷端視神經(jīng)可見(jiàn)生長(zhǎng)較長(zhǎng)的神經(jīng)纖維 ×200

Figure 9 The nerve fibers at broken stump of optic nerve of neonate rat

圖10 鍍銀染色出生3天大鼠視神經(jīng)移植組，斷端視神經(jīng)可見(jiàn)再生纖維明顯減少 ×200

Figure 10 The nerve fibers at broken stump of optic nerve of rat 3 days after birth deceased

3 討論

3.1 關(guān)于視神經(jīng)損傷移植模型 視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)纖維束因其纖維來(lái)源比較單一，結(jié)構(gòu)也比較簡(jiǎn)單，它是由視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞發(fā)出的軸突和屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，不含神經(jīng)元，在活體上很容易進(jìn)入，可行神經(jīng)解剖追蹤。另外，視神經(jīng)還是唯一可以接受實(shí)驗(yàn)性處理而又不會(huì)直接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)其它部分的中樞神經(jīng)。自Vaughn等(1970)建立了視神經(jīng)的橫斷損傷模型以來(lái)，由于其操作方便，對(duì)周圍組織損傷小，視神經(jīng)暴露較好，動(dòng)物死亡極少，很快這一模型便被廣泛應(yīng)用于研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、變性與再生[2,3]。在本實(shí)驗(yàn)中成功運(yùn)用這一模型，取得了良好的效果。

3.2 對(duì)本實(shí)驗(yàn)中所用檢測(cè)方法的評(píng)價(jià) 在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用了常規(guī)組織化學(xué)及HRP順行軸突示蹤來(lái)了解在不同移植條件下，橫斷成年大鼠視神經(jīng)的變化情況。HE染色可以了解組織的大體形態(tài)及組織成分的相互毗鄰關(guān)系；組織化學(xué)的方法是根據(jù)某些組織內(nèi)所特有的化學(xué)物質(zhì)(如某些酶類)在一定條件下所出現(xiàn)的呈色反應(yīng)從而確定某種成份的存在。本實(shí)驗(yàn)所用的方法較好地顯示了視神經(jīng)斷端新生的無(wú)髓神經(jīng)纖維，這些纖維有人在脊髓中用電鏡證實(shí)為再生的纖維[4]。用HRP順行示蹤，通過(guò)觀察視神經(jīng)到達(dá)靶區(qū)神經(jīng)元的標(biāo)記情況，間接地了解不同移植物對(duì)橫斷大鼠視神經(jīng)軸突再生的影響。

3.3 不同移植物對(duì)橫斷成年大鼠視神經(jīng)軸突再生的影響 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，橫斷成年大鼠的視神經(jīng)在未接受外來(lái)移植物時(shí)其遠(yuǎn)端視神經(jīng)出現(xiàn)萎縮變細(xì)，極少有新生的軸突。周圍神經(jīng)移植后，可見(jiàn)斷端內(nèi)有大量新生的神經(jīng)纖維，HRP示蹤在視神經(jīng)的靶區(qū)上丘出現(xiàn)了陽(yáng)性標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞。胎鼠視神經(jīng)移植，盡管在兩斷端間形成了瘢痕組織，但瘢痕組織中卻有較多新生的神經(jīng)纖維通過(guò)，這些纖維也使該組大鼠的上丘得到了陽(yáng)性標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞。不幸的是，出生后的視神經(jīng)移植物雖然都能在一定程度上促進(jìn)視神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)，但始終未見(jiàn)有視神經(jīng)靶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記，只是在纖維生長(zhǎng)數(shù)量與長(zhǎng)度上，移植發(fā)育愈早的視神經(jīng)，其斷端新生的纖維數(shù)量愈多，長(zhǎng)度愈長(zhǎng)。這些結(jié)果說(shuō)明，不同的移植物能影響成年大鼠橫斷視神經(jīng)斷端的生長(zhǎng)情況。

3.4 不同移植物對(duì)橫斷視神經(jīng)軸突生長(zhǎng)影響的意義 先前的研究顯示，成年動(dòng)物的腦和脊髓在損傷后，其軸突不能再生以建立正常的連接。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的視神經(jīng)，損傷后絕大部分軸突斷裂的神經(jīng)元會(huì)死亡，存活神經(jīng)元也不能再生其軸突。然而后來(lái)大量研究顯示，通過(guò)改變損傷區(qū)的組織環(huán)境，成年動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷軸突的再生能力會(huì)大大增強(qiáng)，甚至重建功能[5]。其中周圍神經(jīng)移植物刺激中樞神經(jīng)纖維的再生已得到了幾乎所有實(shí)驗(yàn)研究一致的認(rèn)同,本實(shí)驗(yàn)用其作為對(duì)照也不例外，并在視神經(jīng)支配的靶區(qū)得到了陽(yáng)性標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，發(fā)育早期的視神經(jīng)具有較強(qiáng)的刺激中樞神經(jīng)纖維再生的能力，而且發(fā)育視神經(jīng)的這種能力隨著視神經(jīng)的不斷發(fā)育成熟而逐漸喪失。我們?cè)缦鹊难芯堪l(fā)現(xiàn)，發(fā)育早期的視神經(jīng)內(nèi)主要以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主，而出生后則很快就以少突膠質(zhì)細(xì)胞為主。因此，我們不禁要問(wèn)，不同發(fā)育階段大鼠視神經(jīng)內(nèi)的這種變化與它們對(duì)橫斷視神經(jīng)的作用關(guān)系究竟說(shuō)明了什么呢？

3.4.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞與軸突的再生 Smith等(1990)認(rèn)為，在星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化過(guò)程中可產(chǎn)生能刺激軸突生長(zhǎng)的物質(zhì)，其中包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)很少的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及鹼性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。發(fā)育愈成熟的視神經(jīng)其刺激軸突再生的能力愈弱，這與視神經(jīng)在由幼年到成年的過(guò)程中星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)存在的這些刺激物質(zhì)逐漸減少有關(guān)。正是由于發(fā)育視神經(jīng)的這種變化，才導(dǎo)致了其刺激軸突再生能力的變化[6]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果似乎可以說(shuō)明這一點(diǎn)。我們有研究顯示(資料待發(fā)表)，成熟的視神經(jīng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量非常少，而大鼠橫斷的視神經(jīng)處可出現(xiàn)增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞，它是組成膠質(zhì)瘢痕的重要成分[7]。在離體研究中，我們也看到了星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)軸突生長(zhǎng)的機(jī)械性阻擋作用。然而在本實(shí)驗(yàn)中，胎鼠視神經(jīng)移植后20天，雖在兩斷端間形成了瘢痕組織，但其中仍可見(jiàn)大量新生的軸突通過(guò)，并在其靶區(qū)出現(xiàn)了陽(yáng)性標(biāo)記的神經(jīng)元，這些事實(shí)均說(shuō)明，膠質(zhì)瘢痕對(duì)軸突生長(zhǎng)的阻擋作用也不是絕對(duì)的。

3.4.2 少突膠質(zhì)細(xì)胞與軸突的再生 本研究結(jié)果顯示，隨著視神經(jīng)的發(fā)育成熟，其中的少突膠質(zhì)細(xì)胞也在不斷的分化成熟，它能明顯地抑制軸突的生長(zhǎng)。因此，視神經(jīng)內(nèi)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加勢(shì)必加重對(duì)軸突生長(zhǎng)的抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中，橫斷視神經(jīng)不見(jiàn)明顯的軸突再生，而且移植較成熟的視神經(jīng)時(shí)，其促軸突再生能力較胚胎期視神經(jīng)也顯著減弱，從另一個(gè)角度也說(shuō)明少突膠質(zhì)細(xì)胞參與了抑制神經(jīng)纖維的再生延長(zhǎng)?，F(xiàn)在有關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的生長(zhǎng)及再生已得到了越來(lái)越多的神經(jīng)科學(xué)工作者的承認(rèn)，對(duì)于其抑制軸突再生的特性人們也正在尋找對(duì)策，希望能最大限度地促進(jìn)中樞神經(jīng)軸突的再生。有研究顯示，直接應(yīng)用少突膠質(zhì)細(xì)胞毒性物質(zhì)可促進(jìn)損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的再生并重建功能[8]。

少突膠質(zhì)細(xì)胞抑制軸突的生長(zhǎng)依賴于少突膠質(zhì)細(xì)胞所產(chǎn)生的軸突生長(zhǎng)抑制因子，它們包括鞘相關(guān)軸突生長(zhǎng)抑制物NI-35/250(neurite growth inhibitor)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白OMgp(oligodendrocyte-myelin glycoprotein)和鞘相關(guān)糖蛋白MAG(myelin-associated glycoprotein)[9]，通過(guò)敲除編碼這些物質(zhì)的基因，損傷的小鼠脊髓出現(xiàn)了軸突再生及功能重建。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的膜上可能存在著抑制神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的物質(zhì)，這些物質(zhì)可抑制損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)纖維的再生延長(zhǎng)及功能重建。

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Effects of transplanted optic nerve of different ontogenetic stages on regeneration of axons in the optic nerve of adult rat

HE Jiaquan1，YANG Zhong2，CAI Wenqin2

(1.DepartmentofNeurosurgery,NanchongCentralHospital，Nanchong637000,Sichuan;2.DepartmentofHistologyandEmbryology,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

Objective To explore the effects of transplanted optic nerve of different ontogenetic stages on the regeneration of axons in the optic nerve of adult rat. Methods The implants of optic nerve in different ontogenetic stages were transplanted into the gap of transected optic nerve of adult rat, while the sciatic nerve as a control; HE staining, silver staining and nerve tracing were used to detect the axon regeneration of optic nerve in adult rats. Results The same as the sciatic nerve implants, a lot of axons got through the gap of transected optic nerve of adult rat 20 days later in the group that the optic nerve implants of embryonic day 18 rat were grafted， and the HRP nerve tracing demonstrated that the tracer got to the colliculus superior which is the target of optic nerve, but such a situation was never observed in the implantations of other ontogenetic stage of optic nerve graft, the younger the grafts, the more the neurite of optic nerve stump of the adult rat and the longer that extended . Conclusion Some neurite growth inhibitors must attach to oligodendrocyte from the CNS of rat, they can inhibit the neurite regeneration and functional reestablishment of injured CNS nerve fibers.

Optic nerve； Transplantation； Central nervous system; Regeneration

全軍九五重點(diǎn)攻關(guān)課題(96M090)

R-33

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.06.002

2014-07-24； 編輯： 母存培)

通迅作者：蔡文琴，Tel:65318230