馬現(xiàn)成，任國莉，劉宇，劉淑靜，王忠超，張躍華*

(1.佳木斯大學(xué)理學(xué)院，黑龍江佳木斯154007；2.黑龍江省湯原波巴布生物科技有限公司)

高產(chǎn)漆酶真菌菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究

馬現(xiàn)成1，任國莉1，劉宇1，劉淑靜1，王忠超2，張躍華1*

(1.佳木斯大學(xué)理學(xué)院，黑龍江佳木斯154007；2.黑龍江省湯原波巴布生物科技有限公司)

從6株野生真菌和5株食用真菌中篩選出高產(chǎn)漆酶菌株，并對篩選出的野生菌株漆酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步探究。使用G-PDA確定菌株的產(chǎn)漆酶能力，然后通過液體發(fā)酵對產(chǎn)生的粗酶液進(jìn)行酶活力測定，確定高產(chǎn)漆酶菌株，最后分別在不同pH和溫度下進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)探究。 初步篩選結(jié)果：第7天時(shí)，05號(hào)菌絲直徑最大89.1mm，08號(hào)顯色圈直徑最大76.8mm，04號(hào)的顯色圈顏色最深，09號(hào)顯色反應(yīng)最不明顯。對于漆酶活力：04號(hào)活力最高262.7U/mL，其次是08號(hào)和05號(hào)分別為255.3 U/mL、203.9 U/mL。01和06號(hào)酶活力達(dá)到最大所需時(shí)間最短。 酶學(xué)性質(zhì)方面，08號(hào)的最適pH是3.2、最適溫度是40℃；在不同pH、溫度下分別保溫2h， pH=4.0酶活力殘余率為94.20%；溫度在20～40℃內(nèi)，酶活力殘余率在99.00%以上。結(jié)果表明，0.04%G- PDA最適作為產(chǎn)漆酶真菌的初篩培養(yǎng)基；高產(chǎn)漆酶能力的菌株有 04、05和08號(hào)菌株，且08號(hào)菌株漆酶的最適應(yīng)用條件是pH=4.0、溫度為40℃。

真菌；漆酶；篩選；酶學(xué)性質(zhì)

漆酶(Laeease)是一種含銅多酚氧化酶，主要存在于植物和微生物體內(nèi)，能夠催化氧化多種芳香族和非芳香族化合物，同時(shí)氧氣被還原為水[1]。日本學(xué)者Yoshida在1883年于漆樹汁液中首次發(fā)現(xiàn)漆酶[2]；1895年，Bertrand 第一次將其以生漆固化的活性物質(zhì)分離出來，并首次將其命名為漆酶[1]。

19世紀(jì)末，研究人員發(fā)現(xiàn)一些高等真菌也能分泌漆酶[4]。經(jīng)過一個(gè)多世紀(jì)的研究發(fā)現(xiàn)漆酶廣泛存在于擔(dān)子菌、多孔菌及子囊菌等菌中，其中最主要的漆酶生產(chǎn)者是擔(dān)子菌的白腐真菌[5]。由于漆酶作用底物的廣泛性和非底物特異性，因而漆酶可以廣泛地運(yùn)用于造紙業(yè)、酒類制造、食用菌生產(chǎn)和飲料制造等行業(yè)。隨著漆酶的應(yīng)用研究取得更大的突破性成果和顯著性成就，漆酶對染料等污染物降解及環(huán)境生物修復(fù)等更多領(lǐng)域也有著重要的應(yīng)用價(jià)值。因而，真菌漆酶的生產(chǎn)也越來越受到人們的關(guān)注，大量的研究工作圍繞如何提高真菌漆酶的產(chǎn)量而展開。本文主要研究的是高產(chǎn)漆酶菌株篩選及漆酶酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

本次篩選實(shí)驗(yàn)共選用了11種真菌菌株，其中5株為佳木斯大學(xué)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室保存的食用菌，分別是香菇(Lentinusedodes)01號(hào)菌株、金針菇(Flammulinavelutipes)02號(hào)菌株、雞腿菇(Coprinuscomatus)03號(hào)菌株、杏鮑菇(Pleurotuseryngii)04號(hào)菌株、側(cè)耳(Pleurotusostreatus)05號(hào)菌株；另外6株為伊春市仙翁山國家森林公園采集分離，分別是毛木耳(Auriculariapolytricha)06號(hào)菌株、香栓菇(Trametessuaveloens)07號(hào)菌、樺褶孔菌(Lenzitesbetulina)08號(hào)菌株、紅乳菇(Lactariusacris)09號(hào)菌株、淡黃木層孔菌(Phellsnusgilvus)10號(hào)菌、楊樹菇(Agrocybeaegerita)11號(hào)菌株。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂 16～20，pH 自然。

愈創(chuàng)木酚PDA選擇培養(yǎng)基(G-PDA)：PDA培養(yǎng)基中添加0.04%的愈創(chuàng)木酚[6]。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：在液體PDA的基礎(chǔ)上，KH2PO42，MgSO41.5，VB1微量[7]。

1.3 操作方法

1.3.1 愈創(chuàng)木酚濃度對顯色圈的影響。取28℃恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)7天直徑為8.5mm的08號(hào)菌株菌片，分別轉(zhuǎn)接到添加愈創(chuàng)木酚濃度為0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%的PDA平板培養(yǎng)基上。置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每個(gè)梯度5個(gè)重復(fù)。

1.3.2 G-PDA培養(yǎng)基初篩。取活化培養(yǎng)7天直徑為8.5mm的菌片，轉(zhuǎn)接到G-PDA平板培養(yǎng)基中心位置，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。每隔24h觀察記錄一次顯色圈變化情況，每個(gè)菌株5個(gè)重復(fù)。

1.3.3 液體發(fā)酵復(fù)篩。在200mL錐形瓶中加入100mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接入活化培養(yǎng)7天直徑為8.5mm的菌片3個(gè)。在28℃、130r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，從第5天開始測定酶活力。

1.3.4 粗酶液提取及活性測定。發(fā)酵液在4℃、5000r/min條件下離心15min，取上清液即為粗酶液[8]。取粗酶液、0.5mmol/L的ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)及pH為4.8的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液各1mL，分別在30℃保溫5mins，混合反應(yīng)30s后，在波長420nm的紫外-可見分光光度計(jì)中測定吸光度變化。定義每分鐘轉(zhuǎn)化1μmol的底物所需的酶量為一個(gè)酶活力單位，用U/mL表示[9]。

1.3.5 酶的最適pH及pH穩(wěn)定性[10]。在不同pH的緩沖液中按標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活，以酶活力最高時(shí)的pH為最適反應(yīng)pH。將酶液在30℃不同pH的緩沖液中保存2h，按標(biāo)準(zhǔn)方法測定殘余酶活，以未經(jīng)保存處理的酶液酶活力為100%。

1.3.6 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性[11]。在不同溫度條件下按標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活，以酶活力最高時(shí)的溫度為最適反應(yīng)溫度。酶液在不同溫度下保溫2h，快速冷卻至室溫，按標(biāo)準(zhǔn)方法測定殘余酶活，以未經(jīng)保溫處理的酶液酶活力為100%。

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度愈創(chuàng)木酚對顯色圈影響結(jié)果

08號(hào)菌株在不同濃度G-PDA平板培養(yǎng)基上的生長情況及顯色圈(氧化圈)顏色深度(見表1，見圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在第7天時(shí)，0.02%的G-PDA上的08號(hào)菌絲長滿整個(gè)平板；當(dāng)愈創(chuàng)木酚的濃度大于0.04%時(shí)，雖然顯色圈的顏色比較深，但是對菌株的生長會(huì)產(chǎn)生比較明顯的抑制作用；而當(dāng)愈創(chuàng)木酚濃度小于0.04%時(shí)，顯色圈的顏色會(huì)比較淺且出現(xiàn)顯色圈所需的時(shí)間較長。菌株在0.04%的G-PDA上培養(yǎng)24h就明顯出現(xiàn)顯色圈，且沒有明顯抑制作用，故在真菌菌株具有產(chǎn)漆酶能力的初步確定時(shí)，選用0.04%的G-PDA最為合適。

表1 不同濃度愈創(chuàng)木酚對08號(hào)的影響

注：+淺；++深；+++很深。

圖1 不同濃度G-PDA上菌株的長勢情況

2.2 初篩結(jié)果

各菌株在G-PDA上的顯色反應(yīng)結(jié)果表明(見表2)，11種真菌在G-PDA上均有一定程度的顯色反應(yīng)。05號(hào)菌株菌絲生長速度最快，在第7天直徑達(dá)到89.1mm(平板直徑90mm)；而第7天時(shí)，08號(hào)菌株的顯色圈最大，達(dá)到76.8mm；04號(hào)菌株的顯色圈顏色最深。直到第5天以后，09號(hào)菌株才出現(xiàn)顏色很淺的顯色圈，菌絲的生長速度也明顯落后于其他菌株，其產(chǎn)漆酶能力可以忽略，而其他10種菌株均具有一定產(chǎn)漆酶能力。

表2 菌株在G-PDA上的顯色反應(yīng)結(jié)果

注：-無；+淺；++深；+++很深。

2.3 復(fù)篩結(jié)果

對菌種進(jìn)行液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖2，圖3)：食用菌的酶活力普遍比較高，而野生菌的酶活力普遍較低。除部分菌株在第7天酶活力達(dá)到最大值，其他菌株酶活力達(dá)到最大值的時(shí)間主要集中在10～13天。食用菌中酶活力最高的是04號(hào)菌株，在第11天達(dá)到最高262U/mL；其次為05號(hào)菌株，在第13天達(dá)到203 U/mL。01號(hào)菌株酶活力最大值最先出現(xiàn)。野生菌中酶活力最高的是08號(hào)菌株，在第11天達(dá)到最大255 U/mL，其他的菌株的酶活力均集中100 U/mL以下，酶活力最先出現(xiàn)最大值的是06號(hào)菌株。

圖2 食用菌液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶酶活情況

圖3 野生菌液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶酶活情況

結(jié)合顯色反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，酶活力較高的菌株不僅顯色反應(yīng)出現(xiàn)較早，而且顯色強(qiáng)烈或顯色圈直徑較大。最終確定04、05和08號(hào)3種菌株為高產(chǎn)的漆酶菌株，而01和06號(hào)菌株的酶活力出現(xiàn)最大值所需的時(shí)間最短，在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中也有著比較重要的意義。

2.4 酶的最適pH及pH穩(wěn)定性

不同pH對08號(hào)菌株酶活力的影響及pH穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖4)，pH=3.2時(shí)08號(hào)菌株的漆酶活性最高。隨著pH值得增加到4.0以后，酶活力開始大幅度的下降。30℃條件下，酶液在不同pH的緩沖液中保存2h，殘余的酶活力均在40%以上，在pH4.0～4.8范圍內(nèi)，酶活力殘余率超過90%。pH=4.0時(shí)，酶活力殘余率最高94.20%，而pH=3.2時(shí)，酶活力殘余率僅有68.50%。因此08號(hào)菌株的漆酶應(yīng)用最適pH為4.0。

圖4 pH對08號(hào)菌株漆酶活力影響及pH穩(wěn)定性

2.5 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

不同溫度對08號(hào)菌株酶活力的影響及溫度穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖5)，08號(hào)菌株酶活力的最適溫度為40℃。隨著溫度超過40℃，酶活力逐漸下降，且當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)酶活力殘余率僅有9.17%。在20～40℃范圍內(nèi)，酶液保存2h對酶活力影響很小，酶活力殘余率在99.00%以上。故08號(hào)菌株漆酶的最適應(yīng)用溫度為40℃。

圖5 溫度對08號(hào)菌株的漆酶酶活影響及溫度穩(wěn)定性

3 討論與展望

在產(chǎn)漆酶菌株的初篩中，以愈創(chuàng)木酚為底物進(jìn)行顯色反應(yīng)能夠確定菌株是否具有產(chǎn)漆酶能力，但不能判斷產(chǎn)漆酶能力大小。故需要通過液體搖瓶發(fā)酵，提取粗酶液進(jìn)行精確的酶活力檢測。通過部分野生菌和食用菌的產(chǎn)漆酶能力比較發(fā)現(xiàn)，野生菌的漆酶生產(chǎn)能力相對較弱。因?yàn)槭秤镁ㄟ^研究人員的馴化、選育或基因改造，能夠很好地適應(yīng)于含有大量木質(zhì)素和纖維素的木屑等做的菌袋并且生長速度很快，所以具有較好的產(chǎn)漆酶能力。在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用漆酶降解作用時(shí)，不僅需要了解漆酶的最適pH和溫度，更需要了解漆酶活性在不同pH和溫度下的穩(wěn)定情況。

在環(huán)境問題日益惡化的今天，將漆酶應(yīng)用于污染物治理有著重要的應(yīng)用價(jià)值和實(shí)際意義。因此在產(chǎn)漆酶菌株的篩選中，不僅需要具有高產(chǎn)能力的菌株，更需要能夠在最短時(shí)間中達(dá)到最大酶活力的菌株。所以對于篩選出的高產(chǎn)菌株還要進(jìn)一步的探索，以便縮短出現(xiàn)最大酶活所需的時(shí)間和提高漆酶活力。如：(1)在液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備中，選擇合適的碳源和氮源；(2)在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Cu2+等有促進(jìn)產(chǎn)酶作用的誘導(dǎo)因子；(3)對漆酶活性最大值出現(xiàn)較早的菌株和漆酶活力較大的菌株利用細(xì)胞融合技術(shù)處理；(4)利用基因工程方法，對產(chǎn)漆酶菌株進(jìn)行基因改造。

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Screening of High-yield Laccase Fungal Strains and Enzymatic Characteristics Study

Ma Xiancheng1, Ren Guoli1, Liu Yu1, Liu Shujing1, Wang Zhongchao2, Zhang Yuehua1*

(1.College of Science, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007;2.Tangyuan Bo Ba-bu Biotechnology Co. Ltd. Heilongjiang)

Object: Laccase High-yielding strains are screened from 6 wild fungi and 5 edible fungi. And a preliminary study of laccase enzymatic characteristics of screened wild yield laccase strains. Method: The use of G-PDA identified 11 kinds of fungal laccase production capacity. Then, the crude enzyme solution generated by liquid fermentation activity,which was measured, and got High-yielding strains of laccase. At last,Laccase put separately at different pH and temperature measurement of enzyme activity. Results: Preliminary screening results: In the first 7 days, No.05 mycelium largest diameter is 89.1mm, No.08 color-circle diameter is 76.8mm, No.04 color-circle color is the deepest, The color reaction No.09 is the most obvious. For laccase activity: No.04 highest enzyme activity is 262.7U/mL. Secondly, No.08 , No.05 are 255.3U/mL, 203.9U/mL respectively. Enzyme activity reached maximum shortest is No.01 and No.06. In terms of the enzymatic properties ,the optimum pH is 3.2, the optimum temperature is 40℃ of No.08 strain. At pH=4.0, the residual of enzyme activity was 94.20%; In the 20～40 ℃, the lowest rate of residual enzyme activity was 99.00%. Conclusion: 0.04% G-PDA as the optimal screening fungal laccase production medium. Strain has the ability to determine the High - yielding of laccase for No.04, No.05 and No.08 strains. And 08 strains of Laccase optimal utilization conditions is pH=4.0, and temperature is 40℃.

Fungi; Laccase; Screening;Enzymatic characteristics

2015-04-30

佳木斯大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(xslz2014-006)；佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)校級面上項(xiàng)目(L2013-076)

馬現(xiàn)成(1993-)男，本科在讀，環(huán)境科學(xué)專業(yè)，E-mail: 15945886494@163.com；*

TQ920.6

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.04.003