艾灸對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠Th1/Th2漂移特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3的干預(yù)作用*

★周志剛1顏春明2張學(xué)強(qiáng)3覃肯3郭業(yè)頻1*通信作者：郭業(yè)頻，男，副教授。(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院南昌 330004；2.葡萄牙傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)學(xué)院中醫(yī)系里斯本；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院南昌 330004)

摘要：目的：觀察艾灸對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠Th1/Th2漂移特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3的干預(yù)作用。方法：30只大鼠用弗氏佐劑進(jìn)行造模，隨機(jī)分成模型組、艾灸組，西藥組三組，10只正常大鼠作為空白對(duì)照組，經(jīng)處理后，觀察T-bet和GATA-3的表達(dá)。結(jié)果：模型組大鼠的脾臟細(xì)胞中T-bet表達(dá)較正常組明顯增高，差異存在著顯著性意義(P<0.01)，艾灸組和西藥組T-bet表達(dá)升高，但差異無顯著性意義(P>0.05)；模型組大鼠的脾臟細(xì)胞中GATA-3表達(dá)較正常組降低，差異存在著顯著性意義(P<0.05)；艾灸和西藥組中脾臟細(xì)胞中GATA-3表達(dá)較正常組降低，但差異無顯著性意義(P>0.05)。結(jié)論：艾灸可能通過抑制RA大鼠T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，降低T-bet轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)GATA3轉(zhuǎn)錄，調(diào)整Thl/Th2功能失衡達(dá)到治療目的。

關(guān)鍵詞：艾灸；T-bet；GATA-3；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主的慢性全身性自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹和疼痛、晨僵、畸形和功能損害，病理特征是關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥、血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞[1]，我國(guó)RA患病率大約為0.33%，大多為女性，本病致殘率高，因RA的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前對(duì)RA尚無特效治療治法。但大多學(xué)者認(rèn)為是遺傳因素、環(huán)境因素和免疫功能失調(diào)等各種因素綜合作用的結(jié)果?，F(xiàn)代研究已證明正常生理狀態(tài)下Th1與Th2細(xì)胞分化存在著一種動(dòng)態(tài)平衡與交互抑制，Th1/Th2細(xì)胞分化的動(dòng)態(tài)平衡一旦被打破，T細(xì)胞就會(huì)朝著Th1細(xì)胞分化占優(yōu)勢(shì)或Th2細(xì)胞分化占優(yōu)勢(shì)的“漂移狀態(tài)”發(fā)展，機(jī)體因此而發(fā)病。因此T細(xì)胞亞群Th1、Th2分化失衡被認(rèn)為是誘導(dǎo)RA發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[2]。

研究已經(jīng)證明針灸具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)等作用，腧穴大多為足三里、脾俞、腎俞、大椎、命門等[3]。但艾灸法對(duì)RATh1/Th2漂移的干預(yù)實(shí)驗(yàn)還鮮有報(bào)道。本課題是以Th1、Th2的兩個(gè)特異性指標(biāo)T-bet和GATA-3來觀察RA大鼠的Th1/Th2細(xì)胞分化及艾灸干預(yù)后表達(dá)趨勢(shì)，以期深入揭示艾灸治療RA的作用機(jī)理。

1材料和方法

1.1材料健康SD雄性成年大鼠，體重在200~300g之間，清潔級(jí)(動(dòng)物由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心提供)。

1.2方法40只SD健康大鼠購(gòu)回后經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，隨機(jī)抽取10只，納入空白對(duì)照組，于大鼠右側(cè)后肢足墊皮內(nèi)注射0.1mL生理鹽水，30只大鼠作為納入模型組中，于足跖底部注射0.1mL完全弗氏佐劑進(jìn)行造模[4]造模，造模成功的模型組大鼠隨機(jī)分成模型組、艾灸組，西藥組各10只，右側(cè)后肢足墊皮內(nèi)注射0.1mL生理鹽水的10只大鼠做為空白對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組和模型組不做任何治療，只做與艾敏灸組相同的固定。艾灸組將大鼠固定，大鼠大椎、脾俞、腎俞、命門、足三里參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》動(dòng)物穴位圖譜定位。每天一次，連續(xù)6天為一療程，連續(xù)3個(gè)療程；西藥組予甲氨蝶呤水溶液(3.8mg/kg)每周1次灌胃。

1.3標(biāo)本采集大鼠脾組織的采集可參照前期實(shí)驗(yàn)方法采集[5]。

1.4T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的擴(kuò)增及檢測(cè)將采集后的脾細(xì)胞懸液按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)[5]，表達(dá)量按參考文獻(xiàn)進(jìn)行計(jì)算，引物序列見表1。

表1　T-bet、GATA-3和β-actin序列

2結(jié)果

結(jié)果顯示：與正常組比，模型組大鼠的脾臟細(xì)胞中T-bet表達(dá)明顯增高，差異存在著顯著性意義(P<0.01)，艾灸組和西藥組的T-bet表達(dá)升高，差異無顯著性差異(均P>0.05)，與模型組比較，艾灸組和西藥組的T-bet表達(dá)明顯降低，差異存在著顯著性意義(P<0.01，P<0.05)；與正常組比較，模型組大鼠的脾臟細(xì)胞中GATA-3表達(dá)量降低，差異存在著顯著性意義(P<0.05)；與模型組相比，艾灸組和西藥組中GATA-3表達(dá)明顯升高，差異無著顯著性意義(P>0.05)，與模型組比較，艾灸組和西藥組的GATA-3表達(dá)明顯降低，差異存在著顯著性意義(P<0.01，P<0.05)。

表2　大鼠脾組織的T-bet和GATA-3表達(dá)

注：與正常組比較，△P<0.01，▽P>0.05；與模型組比較，▲P<0.01，▼P>0.05。

3討論

RA是一種以對(duì)稱性、侵蝕性滑膜炎為病理特征，反復(fù)發(fā)作多發(fā)性小關(guān)節(jié)腫痛，晚期出現(xiàn)關(guān)節(jié)僵硬、畸形為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病。屬于中醫(yī)痹證范疇，與中醫(yī)古籍記載的“頑痹”、“骨痹”、“歷節(jié)”、“鶴膝風(fēng)”等病證相類似[6]。痹證的發(fā)生是由正氣不足為內(nèi)因，風(fēng)、寒、濕六淫邪氣感染為外因，內(nèi)因、外因共同作用的結(jié)果[7]。灸法主要是借助艾炷燃燒發(fā)出的熱量給人體組織以溫?zé)嵝源碳?，通過經(jīng)絡(luò)腧穴的“小刺激大反應(yīng)”作用，并將刺激轉(zhuǎn)換成良性生物信息，從而達(dá)到防治疾病目的的一種方法[8-9]。艾灸對(duì)RA有良好的治療效果，且無副使用[10-11]?！白闳铩毖▽傥附?jīng)，是治療下肢痿痹之要穴。脾經(jīng)與胃經(jīng)相表里，且脾胃被乃后天之本，具有運(yùn)化水谷，化生氣血之功，故合取“脾俞”調(diào)理脾胃二經(jīng)，有補(bǔ)養(yǎng)全身氣血之功效。“腎俞”屬足太陽膀胱經(jīng)，具有補(bǔ)虛培元之功，對(duì)臟腑、經(jīng)絡(luò)、氣血津液的失調(diào)都有很好的調(diào)整作用。

研究表明：Th1、Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子平衡狀態(tài)的紊亂是造成RA的主要原因，Th1細(xì)胞在RA中占主導(dǎo)地位，如IFN-γ,IIL-2，IL-6，L-4，IL-10等細(xì)胞因子分泌異常，這些細(xì)胞因子共同參與病理過程如滑膜增生、血管翳形成和軟骨破壞等[12-15]。以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究曾表明：艾灸足三里、腎俞、脾俞等穴能明顯減輕RA大鼠局部原發(fā)性和繼發(fā)性腫脹，提高實(shí)驗(yàn)RA大鼠痛閾，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫因子，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)等作用[16]，但細(xì)胞因子分泌Th1/Th2細(xì)胞調(diào)控。Th細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞過程中受到轉(zhuǎn)錄因子T-bet的調(diào)控，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，分泌促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[17]，是Th1細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子[18-19]。所有的Th2細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄都需要GATA-3的參與，主要介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，分泌抗炎因子，提高黏膜耐受性[18]。GATA-3特異性表達(dá)于Th2細(xì)胞，是Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子[20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組大鼠的脾臟細(xì)胞中T-bet表達(dá)明顯增高，GATA-3表達(dá)顯著降低，差異存在著顯著性意義(均P<0.01)，說明在RA期間，大鼠T細(xì)胞分化向著Th1分化，同時(shí)抑制向Th2細(xì)胞分化，總的趨勢(shì)向Th1漂移，Th1/Th2功能失衡；經(jīng)艾灸治療后，脾臟細(xì)胞中T-bet表達(dá)明顯降低，GATA-3表達(dá)顯著升高，說明艾灸干預(yù)后大鼠T細(xì)胞分化向著Th2分化，同時(shí)抑制向Th1細(xì)胞分化，Th1/Th2功能基本恢復(fù)正常。

由此可見，艾灸足三里、脾俞、腎俞、命門、大椎等腧穴可以抑制RA大鼠T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，降低T-bet轉(zhuǎn)錄，抑制促炎因子分泌，減輕炎性反應(yīng)，阻止滑膜下層內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、內(nèi)皮小靜脈形成等病變；促進(jìn)RA大鼠T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，促進(jìn)GATA3轉(zhuǎn)錄，加快抗炎因子分泌，上調(diào)T細(xì)胞耐受性，抑制RA發(fā)生發(fā)展，恢復(fù)RAThl/Th2功能失衡。

參考文獻(xiàn)

[1]葛均波，徐永健.內(nèi)科學(xué)[M].第8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013.

[2]郭明，安高，封桂英，等.CD4+T細(xì)胞亞群在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014,30(9):1 004-1 007.

[3]房繄恭.針灸對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2006，24(8)：1 447-1 449.

[4]蘇暢，張成義，韓慧明，等．佐劑性關(guān)節(jié)炎的佐劑劑量條件探索[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，2(4):306-307．

[5]周志剛，陳麗旦，鄒樹仁，等.左歸丸對(duì)陰虛陽亢大鼠Th1/Th2細(xì)胞漂移特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet及GATA-3 mRNA的干預(yù)作用[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2010，12(4)：52-54.

[6]章婷婷,王念宏.艾灸治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床與實(shí)驗(yàn)研究[J].針灸臨床雜志，2007，23(8)：69-70.

[7]李學(xué)勇，喻建平.中醫(yī)藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎研究進(jìn)展[J].實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2007，7(1)：87-88.

[8]謝宇峰，陳赟，馮軍，等.艾灸預(yù)處理對(duì)胃黏膜細(xì)胞調(diào)控作用的研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)藥，2014,45(9):72-75.

[9]李迎紅，李敏，郭義，等.從“穴感經(jīng)傳”看腧穴放大效應(yīng)[J].中國(guó)針灸，2013，33(10)：910-912.

[10]郝鋒，胡玲，羅磊，等．隔姜灸對(duì)活動(dòng)期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床療效的影響[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2011，23(4):313-316.

[11]張鐳瀟，吳佳，蘭穎，等．針灸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床及機(jī)理研究進(jìn)展[J].黑龍江中醫(yī)藥，2013，42(1):51-52．

[12]Boissier MC．Cell and cytokine imbalances in rheumatoid synovitis[J].Joint Bone Spine，2011，78(3):230-234．

[13]Rengarajan J, Szabo SJ, Glimcher LH.Transcriptional regulation of Th1/Th2polarization. Immunol Today, 2000,21:479-483.

[14]Ruschpler P,Stiehl P.Shift in Th 1(IL-2 and IFN-gamma)and Th2 (IL-10 and IL-4)cytokine mRNA balance within two new histological main-types of rheumatoid arthritis(RA)[J].Cell Mol Biol,2002,48(3):285-293.

[15]程惠麗,郭君.Thl/Th2細(xì)胞因子平衡與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)學(xué),2006,27(3):334.

[16]羅磊，胡玲，宋小鴿，等.艾灸對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠跖關(guān)節(jié)中細(xì)胞因子的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2011，4(6):416-419．

[17]Fields PE,kini ST,Flavell NA .Cutting edge:changes in histone acetylation at the IL-4 and IFN-γ loci accompany Th1/Th2 differenitation[J].J Immunol ,2002,169(2):647-650.

[18]魏海明.Th1/Th2極化：轉(zhuǎn)錄因子的作用[J].上海免疫學(xué)雜志，2001，21(6)：379-381.

[19]秦衛(wèi)兵.Th1和Th2細(xì)胞在體內(nèi)的分化[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè),2002，25(1)：42-46.

[20]張琦，董莉，李麗珍，等.以T-bet/GATA-3的比率作為評(píng)價(jià)哮喘患者Th1/Th2失衡指標(biāo)的探討[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2005，21(1):118-190.

(收稿日期：2015-03-03)編輯：王河寶

*基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)(原江西省衛(wèi)生廳)資助(2009A055)。

中圖分類號(hào)：R245.81

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B