曾維才,于志龍,張文華,石

(四川大學(xué) 皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610065)

·研究報(bào)告——生物質(zhì)活性成分·

牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的抑制

(四川大學(xué) 皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610065)

通過考察H2O2濃度和作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞活力的影響，確定PC12細(xì)胞氧化損傷模型的建立條件；通過細(xì)胞活力及形態(tài)分析，測(cè)定牛毛水解物對(duì)H2O2致PC12細(xì)胞氧化損傷的抑制作用。結(jié)果表明，H2O2濃度0.15 mmol/L、作用時(shí)間2 h為建立PC12細(xì)胞氧化損傷模型的理想條件；不同質(zhì)量濃度的牛毛水解物(10、 20、 40、 60、 80 mg/L)可有效抑制H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的氧化損傷，使細(xì)胞活力達(dá)到58.79%、 67.53%、 76.89%、 85.96%、 87.58%，也能在一定程度上修復(fù)氧化損傷的細(xì)胞，使其活力恢復(fù)至53.69%、 57.18%、 62.56%、 65.68%、 67.23%，還能有效地維持細(xì)胞原有的形態(tài)特征。

牛毛;水解物;PC12細(xì)胞;氧化損傷;抑制作用

牛毛是畜牧養(yǎng)殖業(yè)和皮革加工業(yè)的一種副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)85%以上，是一種潛在的可再生動(dòng)物生物質(zhì)資源[1]。牛毛主要由α-螺旋角蛋白構(gòu)成，結(jié)構(gòu)中富含半胱氨酸和雙硫鍵等特殊的氨基酸及官能團(tuán)[2]。因具有特別的化學(xué)組成及空間結(jié)構(gòu)，角蛋白展現(xiàn)出特殊的物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)[3]，已在皮革工業(yè)、農(nóng)牧飼料工業(yè)、材料工業(yè)及日化工業(yè)得到了一定的應(yīng)用[4-7]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是指揮人體進(jìn)行正常生命活動(dòng)的重要生理系統(tǒng)，由神經(jīng)細(xì)胞形成的神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)索、腦和脊髓以及它們之間的連接成分組成[8]。其結(jié)構(gòu)中含有大量的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，能接受全身各處傳入的信息，經(jīng)處理后再輸出運(yùn)動(dòng)性指令，完成各種生命活動(dòng)[9]。同時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)也是人體學(xué)習(xí)、記憶及各種思維活動(dòng)的神經(jīng)基礎(chǔ)，對(duì)其他生命活動(dòng)的正常運(yùn)行有重要作用[10]。由于新陳代謝活躍，中樞神經(jīng)系統(tǒng)極易受到自由基的氧化攻擊，引發(fā)阿茲海默癥、帕金森綜合癥、神經(jīng)萎縮、神經(jīng)衰弱、神經(jīng)瘤等多種嚴(yán)重危害人體健康的神經(jīng)性疾病[11]。大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12)與人體腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞和交感神經(jīng)元具有許多相似的生理特征，能夠分泌并表達(dá)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體，是研究神經(jīng)細(xì)胞常用的一種細(xì)胞系，已被廣泛用于研究物質(zhì)對(duì)神經(jīng)元氧化損傷的影響[12-13]。作者的前期相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，牛毛水解物具有較好的抗氧化活性，能有效清除實(shí)驗(yàn)體系中的多種自由基并抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生[14]。在此基礎(chǔ)上，作者進(jìn)一步觀察牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的抑制作用，以期為其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

牛毛由浙江瑞星皮革有限公司提供，取自成年雄性黃牛(BostaurusdomesticusGmelin)。經(jīng)水洗、除雜，50 ℃干燥3 d，真空保存，備用。樣品標(biāo)本(編號(hào)：013)保存于皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(四川大學(xué))。

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)購于中科院上海細(xì)胞所； H2O2、 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、胰蛋白酶購于美國Sigma-Aldrich公司；堿性蛋白酶Alcalase 2.4L FG(2.4 AU/g)購于丹麥Novo公司； Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養(yǎng)基、小牛血清、L-谷氨酰胺購于成都東勝科創(chuàng)生物有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、青霉素(8×105U/瓶)、鏈霉素(1×106U/瓶)、二甲基亞砜(DMSO)、無水乙醇等其他化學(xué)試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3型酸度計(jì)，杭州奧立龍科技儀器有限公司； Milli-Q Element超低元素型超純水系統(tǒng)，上海晶儀科學(xué)儀器有限公司； MCO-15AC型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司； IX-81型倒置生物顯微鏡，日本Olympus公司；血球計(jì)數(shù)板，上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠； 550型酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牛毛水解物的制備[15]按照作者前期研究確定的實(shí)驗(yàn)方法，制備牛毛水解物并對(duì)其水解度及分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定。取10 g牛毛樣品與100 mL NaOH溶液(體積分?jǐn)?shù)為1%)混合，90 ℃水浴水解2 h，水解液10 000 r/min離心15 min。上清液用HCl溶液(0.5 mol/L)調(diào)pH值至8.5，按酶用量5%(以底物質(zhì)量為基準(zhǔn))加入Alcalase堿性蛋白酶，55 ℃水浴攪拌水解8 h。水解液10 000 r/min離心15 min，上清液冷凍干燥得牛毛水解物。用該方法得牛毛水解物8.79 g，牛毛的水解率為87.9%。蛋白質(zhì)的水解度(DH)是指蛋白質(zhì)在水解過程中裂解的肽鍵數(shù)占蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)的百分?jǐn)?shù)，是衡量蛋白質(zhì)水解程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。通過測(cè)定，牛毛水解物的水解度為38.97%，說明牛毛中的角蛋白在堿和堿性蛋白酶Alcalase的化學(xué)-酶協(xié)同作用下發(fā)生了強(qiáng)烈的水解。經(jīng)高效凝膠色譜法分析，牛毛水解物的分子質(zhì)量主要分布在1 600～18 000 u之間[15]。

1.3.2實(shí)驗(yàn)溶液的配制 無菌超純水：超純水在121 ℃、 102.9 kPa條件下滅菌30 min，備用。磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4)：稱取1.56 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)、 0.27 g磷酸二氫鉀、 0.2 g氯化鉀及8.0 g氯化鈉溶于1 000 mL無菌超純水，0.22 μm微孔濾膜過濾后4°C保存，備用。胰蛋白酶溶液(質(zhì)量濃度25 g/L)：稱取2.5 g胰蛋白酶均勻分散于100 mL PBS緩沖液，4 ℃放置過夜，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，每10 mL分裝一小瓶，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)用PBS緩沖液稀釋至質(zhì)量濃度為2.5 g/L。雙抗溶液(青霉素、鏈霉素)：將青霉素溶于4 mL無菌超純水，鏈霉素溶于5 mL無菌超純水，4 ℃保存?zhèn)溆?。? 000 mL RPMI1640培養(yǎng)基使用前加入0.5 mL青霉素溶液和0.5 mL鏈霉素溶液。小牛血清：取-20 ℃凍藏保存的小牛血清在56 ℃水浴條件下孵育30 min，無菌檢驗(yàn)后使用。RPMI1640培養(yǎng)基臨用前加入小牛血清至體積分?jǐn)?shù)為10%。L-谷氨酰胺溶液(0.2 mol/L)：取2.922 gL-谷氨酰胺溶于無菌超純水，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃保存。每1 000 mL RPMI1640培養(yǎng)基使用前加入10 mLL-谷氨酰胺溶液。RPMI1640培養(yǎng)基：取RPMI1640培養(yǎng)基50 g溶于2 000 mL無菌超純水，加入2 g碳酸氫鈉并調(diào)pH值至7.2，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，每500 mL分裝一瓶，-20 ℃保存?zhèn)溆?。牛毛水解物溶液：以RPMI1640培養(yǎng)基為溶劑，配制質(zhì)量濃度分別為10、 20、 40、 60、 80、 100和120 mg/L的牛毛水解物溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩TT溶液(5 g/L)：取0.5 g MTT溶于100 mL PBS緩沖液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃避光保存。

1.3.3 細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 取致密單層的PC12原代細(xì)胞，加入少量PBS緩沖液清洗原培養(yǎng)液及細(xì)胞碎片后棄去PBS緩沖液。加入1 mL胰蛋白酶溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，待細(xì)胞充分消化后棄去胰蛋白酶溶液，加入PBS緩沖液20 mL，用吸管反復(fù)吹打至細(xì)胞均勻分散，將含有細(xì)胞的PBS緩沖液在1 500 r/min、 4 ℃條件下離心10 min，棄去上層清液，重復(fù)操作3次。在離心得到的沉淀中加入RPMI1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每兩天為細(xì)胞更換培養(yǎng)液；每3 d重復(fù)上述操作，為細(xì)胞傳代；每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；參照文獻(xiàn)[16]取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力 MTT比色法是生化實(shí)驗(yàn)中測(cè)定細(xì)胞活力的常用方法。細(xì)胞內(nèi)生成的甲瓚經(jīng)DMSO溶解后形成藍(lán)色溶液并在波長570 nm(或490 nm)處有特征吸收，可通過酶標(biāo)儀測(cè)定溶液的吸光度，根據(jù)溶液吸光度值的大小表征受試細(xì)胞活力的大小[17]。MTT法的具體操作參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行，細(xì)胞活力計(jì)算如下：

細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%

1.3.5 H2O2致PC12細(xì)胞氧化損傷模型的建立 取對(duì)數(shù)生長期PC12細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板，接種密度1×105個(gè)/孔，接種量100 μL/孔。在37 ℃、 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入不同濃度H2O2(0.05、 0.1、 0.15、 0.2和0.25 mmol/L)20 μL分別培養(yǎng)1、 2、 3、 4、 5 h，棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗3次，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，確定合適的H2O2濃度和培養(yǎng)時(shí)間用于PC12細(xì)胞氧化損傷模型的建立。

1.3.6 牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞生長活力的影響 取對(duì)數(shù)生長期PC12細(xì)胞，加入不同質(zhì)量濃度牛毛水解物(10、 20、 40、 60、 80、 100、 120 mg/L)20 μL作用24 h，采用MTT法觀察牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞生長活力的影響，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中牛毛水解物的質(zhì)量濃度范圍。

1.3.7 牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的抑制作用 用不同質(zhì)量濃度范圍的牛毛水解物20 μL與對(duì)數(shù)生長期PC12細(xì)胞作用2 h，PBS緩沖液清洗后加入H2O2(0.15 mmol/L)20 μL作用2 h。采用MTT法測(cè)定不同濃度牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的抑制作用。設(shè)置正常生長的PC12細(xì)胞為空白組，只受H2O2損傷的PC12細(xì)胞為損傷組。

1.3.8 牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的修護(hù)作用 采用不同濃度的牛毛水解物20 μL同已被H2O2氧化損傷的PC12細(xì)胞作用24 h，通過MTT法測(cè)定不同濃度牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的修護(hù)作用。

1.3.9 PC12細(xì)胞的形態(tài)觀察 取空白組、損傷組及牛毛水解物(80 mg/L)作用組的PC12細(xì)胞，分別用PBS緩沖液清洗3次，置于倒置顯微鏡下觀察，對(duì)比各組PC12細(xì)胞外觀形態(tài)的變化。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS12.0軟件(version 12.0 for Windows,

圖1 H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的氧化損傷

SPSS Inc.,CO,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2致PC12細(xì)胞氧化損傷模型的建立

不同濃度H2O2在不同作用時(shí)間內(nèi)對(duì)PC12細(xì)胞的氧化損傷情況如圖1所示。

由圖1數(shù)據(jù)可知，H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的活力有顯著影響。隨H2O2受試濃度(0.05～0.25 mmol/L)的增加，PC12細(xì)胞的活力明顯下降，呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系；同一受試濃度下，隨作用時(shí)間(1～5 h)的延長，PC12細(xì)胞的活力也逐漸下降。結(jié)果表明，H2O2是一種良好的氧化引發(fā)劑，能有效地對(duì)生物細(xì)胞造成氧化損傷，可用于PC12細(xì)胞氧化損傷模型的建立。通常情況下，選取使細(xì)胞活力下降約50%的氧化劑濃度和損傷時(shí)間用于細(xì)胞氧化損傷模型的建立[16]。分析圖1可知，當(dāng)H2O2的濃度為0.15 mmol/L、作用時(shí)間為2 h時(shí)，PC12細(xì)胞的活力降低至48%，接近半數(shù)致死劑量，是較為理想的氧化損傷條件。因此，實(shí)驗(yàn)選用0.15 mmol/L的H2O2與細(xì)胞作用2 h作為建立PC12細(xì)胞氧化損傷模型的條件。

表1 牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞生長活力的影響

表2 牛毛水解物對(duì)H2O2致PC12細(xì)胞氧化損傷的抑制作用

2.2 牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞生長活力的影響

牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞生長活力的影響如表1所示。

由表1可知，不同濃度的牛毛水解物在24 h內(nèi)對(duì)PC12細(xì)胞均具有一定的生理毒性，可在一定程度上降低細(xì)胞的生長活力。當(dāng)水解物濃度高于80 mg/L時(shí)，PC12細(xì)胞的生長活力降低至90%以下，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。因此，選用80 mg/L為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中牛毛水解物的最高受試濃度。

2.3 牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的抑制作用

不同濃度的牛毛水解物對(duì)H2O2致PC12細(xì)胞氧

化損傷的抑制作用如表2所示。

由表2可知，如果將未受H2O2氧化損傷的細(xì)胞活力定義為100%，損傷組細(xì)胞因受到H2O2氧化，細(xì)胞生長受阻，活力下降至48.62%。經(jīng)不同質(zhì)量濃度(10、 20、 40、 60、 80 mg/L)牛毛水解物的作用，各組PC12細(xì)胞在被H2O2氧化損傷2 h后的活力分別維持在58.79%、 67.53%、 76.89%、 85.96%、 87.58%。同氧化損傷組相比，隨著牛毛水解物作用濃度的提高，PC12細(xì)胞對(duì)H2O2氧化攻擊的抵抗力逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞活力降低的情況逐漸得到緩解，表現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，牛毛水解物可有效地降低H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化攻擊，對(duì)H2O2致PC12細(xì)胞的氧化損傷有顯著的抑制作用。

牛毛水解物對(duì)H2O2致PC12細(xì)胞氧化損傷的抑制作用可能與其較強(qiáng)的抗氧化活性有關(guān)[15]。H2O2及其衍生出的羥自由基可與細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成丙二醛等過氧化產(chǎn)物。這些產(chǎn)物同細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)、脂類、糖類等物質(zhì)交聯(lián)，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜的正常生理功能，造成細(xì)胞的氧化損傷，阻礙細(xì)胞的正常生長，最終引發(fā)細(xì)胞的凋亡[19-21]。根據(jù)相關(guān)研究可知[14-15]，牛毛水解物能有效地清除實(shí)驗(yàn)體系中的H2O2及羥自由基，阻斷細(xì)胞膜中自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行，抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，維持細(xì)胞膜完整的生理結(jié)構(gòu)和正常的生理功能。因此，牛毛水解物能提高PC12細(xì)胞對(duì)H2O2氧化攻擊的抵抗力和耐受度，保持細(xì)胞原有的活力，對(duì)H2O2致PC12細(xì)胞的氧化損傷具有顯著的抑制作用。

2.4 牛毛水解物對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的修護(hù)作用

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了牛毛水解物對(duì)已受損PC12細(xì)胞的修護(hù)作用，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，牛毛水解物對(duì)已氧化損傷的PC12細(xì)胞具有一定的修護(hù)作用?？瞻捉M細(xì)胞未受H2O2攻擊，正常生長，細(xì)胞活力為100%；損傷組細(xì)胞經(jīng)H2O2氧化，活力下降至47.25%；各實(shí)驗(yàn)組PC12細(xì)胞在氧化損傷后經(jīng)不同濃度(10、 20、 40、 60、 80 mg/L)牛毛水解物的修護(hù)，細(xì)胞活力恢復(fù)至53.69%、

表3 牛毛水解物對(duì)H2O2致PC12細(xì)胞氧化損傷的修護(hù)作用

57.18%、 62.56%、 65.68%、 67.23%，表現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果說明，牛毛水解物不僅可以提高細(xì)胞對(duì)H2O2氧化攻擊的抵抗力和耐受度，有效地保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，還能在一定程度上對(duì)已氧化受損的細(xì)胞發(fā)揮生物修護(hù)作用，提高其細(xì)胞活力。

牛毛水解物對(duì)細(xì)胞氧化損傷的修護(hù)作用可能與其結(jié)構(gòu)中含有的大量抗氧化性氨基酸及抗氧化性官能團(tuán)有關(guān)。磷脂雙分子層內(nèi)發(fā)生的脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要原因。脂質(zhì)過氧化是一類典型的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，為多不飽和脂肪酸在氧氣作用下逐步發(fā)生的一種氧化變質(zhì)現(xiàn)象。反應(yīng)過程既需要自由基的引發(fā)，也產(chǎn)生大量自由基。同時(shí)，又要依靠自由基的推動(dòng)作用才能進(jìn)一步發(fā)生。在生物體內(nèi)發(fā)生的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量的有毒物質(zhì)，引起生物質(zhì)膜的功能缺失、生化酶活性的減弱、細(xì)胞內(nèi)生物大分子的降解，從而加速細(xì)胞的凋亡[22-24]。研究發(fā)現(xiàn)，牛毛水解物中富含半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等抗氧化性氨基酸及巰基、羥基等具有較強(qiáng)氫質(zhì)子給予能力的官能團(tuán)，能有效的淬滅細(xì)胞內(nèi)外的活性氧、抑制自由基的產(chǎn)生、阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)生與發(fā)展[14-15]，從而有利于生物細(xì)胞膜的再生，對(duì)受損細(xì)胞展現(xiàn)出一定的修護(hù)能力。

2.5 PC12細(xì)胞的形態(tài)觀察

取空白組、損傷組及經(jīng)牛毛水解物(80 mg/L)作用的PC12細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察，各組細(xì)胞的形態(tài)如圖2所示。

圖2 PC12細(xì)胞的形態(tài)觀察

由圖2可知，未受H2O2氧化攻擊的PC12細(xì)胞(圖2a)生長狀況良好，保持原有的梭狀形態(tài)，細(xì)胞兩端的突觸明顯，細(xì)胞連接緊密；受H2O2氧化攻擊的PC12細(xì)胞(圖2b)形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯改變，細(xì)胞形狀轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則的球形及橢圓形，細(xì)胞兩端的突觸收縮，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞間連接疏松，生長狀況不好；經(jīng)牛毛水解物(80 mg/L)的作用(圖2c)，大部分的PC12細(xì)胞能維持原有的細(xì)胞形態(tài)，并表現(xiàn)出良好的生長狀況。細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果說明，牛毛水解物能保護(hù)PC12細(xì)胞免受H2O2的氧化攻擊，維持細(xì)胞原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。

3 結(jié) 論

3.1 實(shí)驗(yàn)確定H2O2濃度0.15 mmol/L、作用時(shí)間2 h為建立PC12細(xì)胞氧化損傷模型的理想條件。

3.2 不同質(zhì)量濃度的牛毛水解物(10、 20、 40、 60、 80 mg/L)均可有效地抑制H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的氧化損傷，使細(xì)胞活力維持到58.79%、 67.53%、 76.89%、 85.96%、 87.58%，也能在一定程度上修復(fù)氧化受損的細(xì)胞，使其活力恢復(fù)至53.69%、 57.18%、 62.56%、 65.68%、 67.23%，還能有效地維持細(xì)胞原有的形態(tài)特征。

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Inhibitory Effect of Bovine Hair Hydrolysate on Oxidative Injury of PC12 Cells

ZENG Wei-cai,YU Zhi-long,ZHANG Wen-hua,SHI Bi

(Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering of the Education Ministry,Sichuan University, Chengdu 610065, China)

The inhibitory effect of bovine hair hydrolysate on the oxidative injury of PC12 cells was investigated.Based on the influence of H2O2concentration and incubation time on cell vitality,the conditions for preparing oxidative injury of PC12 cells were determined.Results showed that 0.15 mmol/L of H2O2and 2h of incubation time were the suiTable conditions to injury PC12 cells for further experiment.According to the measurement of cell vitality and observation of cell morphology,bovine hair hydrolysate (10,20,40,60,80 mg/L) exhibited significant capability to inhibit the oxidative injury of PC12 cells induced by H2O2(recovering the cell viability to 58.79%,67.53%,76.89%,85.96%,87.58%,respectively),and showed the repair ability to the oxidative injury of cells (recovering the cell viability to 53.69%,57.18%,62.56%,65.68%,67.23%,respectively).Meanwhile,it also possessed a strong power to keep the vitality and normal morphology of PC12 cells.

bovine hair;hydrolysate;PC12 cells;oxidative injury;inhibitory effect

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.01.008

2014- 09- 24

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (21276165)；教育部博士點(diǎn)專項(xiàng)基金(20120181110078) 作者簡介：曾維才 (1986—),男,四川敘永人,講師,博士,主要從事廢棄生物質(zhì)的資源化利用研究工作

TQ35；TQ931

A

1673-5854(2015)01- 0043- 06

*通訊作者：石 碧,男,教授,博士,博士生導(dǎo)師,主要從事蛋白質(zhì)化學(xué)方面的研究工作;E-mail:shibi@scu.edu.cn。