宋微珩 蓋趙輝 董鑫 姜淼 孫麗敏

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（GPC-3）是一種癌胚蛋白，主要在發(fā)育期間主導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)形成及生長［1］。GPC-3上的糖基磷脂酰肌醇通過結(jié)合細(xì)胞膜的方式，控制細(xì)胞生長以及細(xì)胞分化。在胚胎發(fā)育期間，GPC-3蛋白表達(dá)具有較強的器官組織特異性和分化特異性，其中肝實質(zhì)細(xì)胞在整個孕期有較高的GPC-3蛋白表達(dá)，而當(dāng)嬰兒從母體分離后，GPC-3在肝實質(zhì)細(xì)胞則無明顯表達(dá)［2］。近年來，有報道稱細(xì)胞角蛋白19（CK-19）是膽管上皮的標(biāo)志物之一，在膽管上皮細(xì)胞有較明顯的表達(dá)［3］。目前，醫(yī)學(xué)界尚無足夠數(shù)據(jù)證明CK-19可作為診斷某一類腫瘤的特異性指標(biāo)，但對腫瘤鑒別具有一定的參考價值［4］。因此，本研究通過聯(lián)合檢測GPC-3和CK-19在肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌表達(dá)水平，并分析兩者與腫瘤分化程度的關(guān)系，探討GPC-3和CK-19在診斷和鑒別肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的價值?，F(xiàn)報道如下。

資料和方法

一、一般資料

選取大慶油田總院病理科2011年1月至2013年3月行肝穿刺及外科手術(shù)切除的肝癌組織157例，其中肝細(xì)胞癌組織85例，膽管細(xì)胞癌組織72例。肝細(xì)胞癌中男58例，女17例，年齡26-85歲，平均年齡（57.65±15.84）歲，中低分化組織69例，高分化組織16例。膽管細(xì)胞癌中男58例，女17例，年齡26～85歲，平均年齡（57.65±15.84）歲，中低分化組織59例，高分化組織13例。兩種癌組織在年齡、性別比例、分化程度比較中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），一般資料具有可比性。

二、材料

鼠抗人GPC-3、CK-19購自福建邁新公司，免疫組化SP試劑盒購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

三、方法

所有標(biāo)本經(jīng)10%的甲醛固定，脫水、浸蠟、包埋，4um厚度連續(xù)切片。隨后進(jìn)行蘇木素－伊紅（HE）染色。染色完畢后進(jìn)行烤片、脫蠟，并放置于乙醇溶液。加入3%H2O2溶液靜置5分鐘。采用PBS緩沖液浸泡3次，每次5分鐘。放入PH6.0的檸檬酸緩沖液高壓高溫修復(fù)。修復(fù)后，置于水中冷卻至37℃，再次采用PBS緩沖液沖洗3次。加入鼠抗人GPC-3，置于4℃冰箱過夜，PBS緩沖液沖洗3次，37℃下加入二抗PV6 000 10分鐘，PBS緩沖液沖洗3次。然后進(jìn)行DAB顯色，終止染色，脫水，并加入二甲苯，封片。最后置于顯微鏡下觀察，GPC-3陽性表達(dá)信號為黃色或棕黃色。CK-9免疫組化染色步驟與GPC-3基本一致，唯一區(qū)別就是CK-19進(jìn)行高壓高溫修復(fù)后，先在37℃下采用胃酶消化1分鐘，隨后步驟與GPC-3一致。CK-19陽性表達(dá)信號為黃色或棕黃色。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用百分比的形式表示，組間比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、GPC-3、CK-19在肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

在GPC-3免疫組化檢測中，肝細(xì)胞癌組織中檢測出75例陽性，陽性表達(dá)率高達(dá)88.24%，而膽管細(xì)胞癌組織中僅有11例表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率為15.28%，兩種組織陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在CK-19免疫組化檢測中，肝細(xì)胞癌表達(dá)均為陰性，膽管細(xì)胞癌組織卻呈現(xiàn)高陽性表達(dá)，表達(dá)率為94.44%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

圖1 A.GPC-3在肝細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)；B.CK-19在膽管細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)

表1 GPC-3、CK-19在肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌及癌旁正常組織中的表達(dá)（例）

二、GPC-3與肝細(xì)胞癌腫瘤分化程度的關(guān)系

在肝細(xì)胞癌中，GPC-3在中低分化組織中的陽性檢出率為97.10%，明顯高于高分化組織陽性檢出率的50.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 GPC-3與肝細(xì)胞癌腫瘤分化程度的關(guān)系（例）

三、CK-19與膽管細(xì)胞癌腫瘤分化程度的關(guān)系

在膽管細(xì)胞癌中，CK-19在中低分化組織中的陽性檢出率為100.00%，明顯高于高分化組織陽性檢出率的69.23%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 CK-19與膽管細(xì)胞癌腫瘤分化程度的關(guān)系（例）

討 論

肝癌是指發(fā)生于肝臟的原發(fā)性惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤，根據(jù)形態(tài)學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)對肝癌的定義，肝癌主要分為3種，分別為肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌以及肝細(xì)胞癌合并膽管細(xì)胞癌［5］。肝細(xì)胞癌和膽管細(xì)胞癌最為常見，也最難區(qū)分［6］。近年來，GPC-3作為肝癌標(biāo)志物被廣泛報道。據(jù)金光植研究［7］顯示，GPC-3在肝癌組織呈高表達(dá)，而在癌旁正常組織基本無表達(dá)。而國外學(xué)者Di Tommaso L等［8］研究結(jié)果進(jìn)一步表明，GPC-3對于肝癌診斷的敏感度為69%，特異度為91%，甚至在AFP為陰性的肝癌患者中，GPC-3蛋白也呈較高的表達(dá)。本研究中，GPC-3在肝細(xì)胞癌組織的陽性表達(dá)率高達(dá)88.24%，明顯高于膽管細(xì)胞癌的15.28%，實驗結(jié)果與上述研究一致。GPC-3在肝細(xì)胞癌呈高表達(dá)，在膽管細(xì)胞癌呈低表達(dá)，其可能的原因為：肝癌祖細(xì)胞逐漸向肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，少數(shù) GPC-3在膽管來源的細(xì)胞中表達(dá)［9］。而GPC-3在中低分化的肝細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于高分化的肝細(xì)胞癌組織，這提示了GPC-3在肝細(xì)胞癌陽性表達(dá)與腫瘤的惡性程度有關(guān)，可作為早期診斷和判斷預(yù)后的指標(biāo)之一。

Jain R等研究［11］指出CK-19是膽管上皮的標(biāo)志物，CK-19可表達(dá)于增生性的膽管上皮、良性膽管細(xì)胞瘤及膽管細(xì)胞癌中。本研究還發(fā)現(xiàn)CK-19在大部分的膽管細(xì)胞癌組織中呈陽性表達(dá)，但在肝細(xì)胞癌中卻均呈陰性。這點與Jain R等研究相符合。CK-19屬于膽管細(xì)胞型細(xì)胞角質(zhì)素，僅在膽管上皮來源的細(xì)胞中表達(dá)［12］。因此，筆者推測高表達(dá)的CK-19肝癌患者屬于膽管細(xì)胞癌的可能性較大。而CK-19在中低分化的膽管細(xì)胞癌組織中的陽性檢出率明顯高于高分化組織，進(jìn)一步提示了CK-19在膽管細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)與膽管細(xì)胞癌侵襲性有關(guān)。這與張世杰［13］報道的低分化膽管細(xì)胞癌與高分化膽管細(xì)胞癌相比，CK-19甚少在高分化膽管細(xì)胞癌表達(dá)一致。因此，CK19表達(dá)可作為早期肝癌復(fù)發(fā)的診斷指標(biāo)，對肝癌預(yù)后情況判斷有參考價值。

綜上所述，GPC-3在肝細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，而CK-19僅在膽管細(xì)胞癌表達(dá)，聯(lián)合檢測CK-19與GPC-3對鑒別診斷肝細(xì)胞癌和膽管細(xì)胞癌有參考價值。

1 范欽橋，陳書偉，陳小雪，等.GPC-3 mRNA與GGT聯(lián)合檢測診斷AFP陰性原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌.中國普通外科雜志，2013，22：59-62.

2 Yao M，Yao DF，Bian YZ，et al.Oncofetal antigen glypican-3 as a promising early diagnostic marker for hepatocellular carcinoma.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2011，10：289-294.

3 Nakano K，Orita T，Nezu J，et al.Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells.Biochem Biophys Res Commun，2009，378：279-284.

4 姚敏，楊君伶，蔚丹丹，等.sICAM-1和GPC-3 mRNA對肝癌診斷與轉(zhuǎn)移監(jiān)測的臨床價值.世界華人消化雜志，2012，20：1927-1932.

5 Yan D，He Q，Chen Y，et al.Detection ofα-fetoprotein and glypican-3 mRNAs in the peripheral blood of hepatocellular carcinoma patients by using multiple FQ-RT-PCR.J Clin Lab Anal，2011，25：113-117.

6 Di Tommaso L，F(xiàn)ranchi G，Park Y N，et al.Diagnostic value of HSP70，glypican3，and glutamine synthetase in hepatocellular nodules in cirrhosis.Hepatology，2007，45：725-734.

7 金光植，顧怡瑾，喻昊，等.AKR1B10聯(lián)合GPC-3在肝細(xì)胞癌免疫組化診斷中的應(yīng)用.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2012，33：625-628.

8 Wang ZS，Wu LQ，Yi X，et al.CK19 can be used to predict the early recurrence and prognosis of HBV-related hepatocellular carcinoma patients with low AFP serum concentration after R0 radical hepatectomy.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2012，34：753-758.

9 王為東，李玉軍.肝細(xì)胞肝癌中端粒酶、p53和CK19的表達(dá)及意義.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2012，28：862-866.

10 張珍妮，匡志鵬，楊帆，等.肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CK19在化學(xué)誘癌過程中的差異表達(dá).腫瘤防治研究，2012，39：1188-1192.

11 Jain R，F(xiàn)ischer S，Serra S，et al.The use of Cytokeratin 19（CK19）immunohistochemistry in lesions of the pancreas，gastrointestinal tract，andliver.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2010，18：9-15.

12 Bioulac-Sage P，Balabaud C.Perinodular CK19 loss in hepatocarcinogenesis.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2011，35：783-785.

13 張世杰，郎振為，王欣欣，等.聯(lián)合應(yīng)用磷脂酰肌醇蛋白多糖－3（GPC-3）和細(xì)胞角蛋白-19（CK-19）免疫組化檢測在肝細(xì)胞肝癌診斷和鑒別診斷中的價值.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，32：653-657.