石　英　周秀文　李　浩　黃國(guó)良

1　福建省漳州市新浦醫(yī)院　363000；　2　福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院；　3　福建省協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科

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他巴唑?qū)谞钕贋V泡細(xì)胞凋亡的影響

石英1周秀文2李浩2黃國(guó)良3

1福建省漳州市新浦醫(yī)院363000；2福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院；3福建省協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科

他巴唑是抗甲狀腺藥物，屬于咪唑類(lèi)化合物，適用于各種典型的甲狀腺亢進(jìn)癥。經(jīng)研究證明，基于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的過(guò)度增生和肥大的原因而形成的甲狀腺腫伴隨著功能的格雷福斯病(GD)，是由于病理改變等原因，使得甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞持續(xù)增生和自然凋亡減緩所造成的[1]。因此，對(duì)抗甲狀腺濾泡細(xì)胞的非正常增生和凋亡是治療甲狀腺功能亢進(jìn)的重要途徑和方法。

1資料與方法

1.1臨床資料實(shí)驗(yàn)所需的甲狀腺組織是屠宰場(chǎng)豬甲狀腺組織，把提取的10塊新鮮組織迅速進(jìn)行組織分離和酶消化，然后送實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。所用試劑有胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)粉、磷酸鹽緩沖液(PBS)干粉、膠原酶、甲狀腺球蛋白克隆抗體等。所用醫(yī)療器械都是實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)器械，符合醫(yī)療實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。比如細(xì)胞培養(yǎng)板、超凈工作臺(tái)、倒置相差顯微鏡、雙重純水蒸餾器、FACScan型流式細(xì)胞儀、電泳儀(DYY-3 IC型)等。

1.2方法

1.2.1主要試劑的配置:上述實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)器械主要是為試劑的合成做更深一步的準(zhǔn)備，比如用RPMI1640培養(yǎng)粉加碳酸氫鈉在pH值為7.2的情況下過(guò)濾、儲(chǔ)存、培養(yǎng)后加入青霉素、鏈霉素和胎牛血清等調(diào)和成RPMI1640培養(yǎng)液，為培養(yǎng)做準(zhǔn)備；然后加入一定比例的胎牛血清，讓RPMI1640培養(yǎng)液中含胎牛血清10%;然后用KCl、NaCl、酚紅、去離子水等材料配置成D-Hanks液(HBSS)，然后低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆茫蝗缓笥昧姿猁}緩沖液(PBS)干粉加去離子水配置成磷酸鹽緩沖液(PBS)；然后用胰蛋白酶加入磷酸鹽緩沖液(PBS)制成0.25%胰蛋白制劑備用；最后甲醇中放入Giesma(薩姆粉)加入甘油和磷酸鹽緩沖液(PBS)混合制成Giesma染色液[2]。

1.2.2培養(yǎng)和鑒別甲狀腺濾泡細(xì)胞(TFC):把取來(lái)的甲狀腺組織剪成小塊，一般是1~3mm，然后用以上準(zhǔn)備的D-Hanks液(HBSS)漂洗，此時(shí)應(yīng)注意去除其中的結(jié)締組織，同時(shí)漂洗時(shí)要充分洗去紅細(xì)胞等物質(zhì)，以免影響實(shí)驗(yàn)效果。然后在37℃的二型膠原酶的消化液中進(jìn)行消化，30min收集1次細(xì)胞，一般收集4~5次即可。然后再把收集的離心過(guò)的細(xì)胞用D-Hanks液(HBSS)沖洗2~3次，最后將其放入含F(xiàn)SC的RPMI1640培養(yǎng)液中，提前準(zhǔn)備好的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行37℃培養(yǎng)4~5d，為了細(xì)胞很好的生長(zhǎng)平均1~2d換1次培養(yǎng)液。甲狀腺濾泡細(xì)胞的檢測(cè)用SABC免疫組化試劑盒進(jìn)行，一般是涂片后用丙酮固定，然后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，大致3次，3min/次。清除氧化物酶后封閉PBS沖洗1次[3]。加入克隆抗體后再進(jìn)行沖洗，此時(shí)再加入鏈霉卵白素，在37℃的情況下30min，再次PBS沖洗，最后用蘇木素復(fù)染即可。

2結(jié)果

2.1用Giesma染色后觀察甲狀腺濾泡細(xì)胞凋亡的影響。他巴唑的濃度依次設(shè)定為1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2，然后觀察可見(jiàn)，隨著濃度的增加，甲狀腺濾泡細(xì)胞的形態(tài)也在改變，詳見(jiàn)表1。

表1　他巴唑的濃度對(duì)甲狀腺濾泡細(xì)胞凋亡的影響(mol/L)

2.2同時(shí)對(duì)同種濃度的他巴唑分別在24h、48h、72h對(duì)甲狀腺濾泡細(xì)胞凋亡的情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其對(duì)甲狀腺濾泡細(xì)胞的凋亡也有影響，詳見(jiàn)表2。

表2　不同時(shí)間他巴唑?qū)谞钕贋V泡細(xì)胞凋亡的影響

2.3把他巴唑與結(jié)構(gòu)相似的藥物比如：咪唑、硫脲進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)咪唑、硫脲這類(lèi)結(jié)構(gòu)類(lèi)似藥物對(duì)甲狀腺濾泡細(xì)胞凋亡情況的影響也有不同，詳見(jiàn)表3。

表3　他巴唑與類(lèi)似結(jié)構(gòu)藥物對(duì)甲狀腺濾泡細(xì)胞凋亡的影響

3討論

眾所周知的，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，并且不帶炎癥等病理變化，是機(jī)體自我更新的必要形式。他巴唑自發(fā)現(xiàn)以來(lái)就是效果較好的抗甲亢藥物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，他巴唑是通過(guò)抑制甲狀腺濾泡細(xì)胞的氧化酶系統(tǒng)來(lái)抑制碘化的[4]。患者在長(zhǎng)期給藥的過(guò)程中，依附性較好，所以才得到廣泛的使用。甲狀腺功能亢進(jìn)是由于甲狀腺濾泡細(xì)胞凋亡受到了某種抑制效果，使得甲狀腺濾泡細(xì)胞長(zhǎng)期不斷地分化增生，從而患者的甲狀腺在功能和形態(tài)上發(fā)生了病理性變化。而在以上結(jié)果中筆者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)他巴唑的濃度為1×10-6時(shí)，對(duì)甲狀腺濾泡細(xì)胞幾乎沒(méi)有誘導(dǎo)其消亡的作用，但隨著濃度的改變，到1×10-3時(shí)，他巴唑?qū)谞钕贋V泡細(xì)胞誘導(dǎo)其消亡的作用最明顯。由此可見(jiàn)，他巴唑?qū)谞钕贋V泡細(xì)胞凋亡的影響是濃度越高，誘導(dǎo)其消亡的比率就越大，形態(tài)功能的變化越大；在不同時(shí)間的情況下，他巴唑?qū)谞钕贋V泡細(xì)胞的影響是時(shí)間越久對(duì)誘導(dǎo)甲狀腺濾泡細(xì)胞消亡的影響就越大，大致成正相關(guān)的關(guān)系；他巴唑中不僅含有硫脲基，還含有咪唑環(huán)。通過(guò)表3可以看出，咪唑?qū)谞钕贋V泡細(xì)胞的凋亡也有誘導(dǎo)作用?？梢缘贸?，他巴唑誘導(dǎo)甲狀腺濾泡細(xì)胞的凋亡不一定只是通過(guò)硫脲基，它還能通過(guò)現(xiàn)在未知的途徑對(duì)甲狀腺濾泡細(xì)胞的凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)。

從以上實(shí)驗(yàn)對(duì)比可以看出，他巴唑?qū)谞钕贋V泡細(xì)胞的凋亡具有很好的誘導(dǎo)作用，濃度在1×10-3時(shí)效果最好，而時(shí)間則是72h內(nèi)，誘導(dǎo)凋亡的作用隨著時(shí)間的增長(zhǎng)呈正相關(guān)的關(guān)系。同時(shí)經(jīng)過(guò)類(lèi)似結(jié)構(gòu)的藥物對(duì)比發(fā)現(xiàn)，他巴唑主要是通過(guò)硫脲基團(tuán)的作用而對(duì)甲狀腺濾泡細(xì)胞的凋亡起誘導(dǎo)作用。

參考文獻(xiàn)

[1]何珂,胡蘊(yùn),毛曉明.淋巴細(xì)胞對(duì)人原代甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.免疫學(xué)雜志,2014,11(1):421-422.

[2]馬文竹.中醫(yī)藥對(duì)甲亢細(xì)胞凋亡影響的研究進(jìn)展〔J〕.光明中醫(yī),2014,6(20):63-64.

[3]連麗新.自噬對(duì)甲狀腺濾泡癌放化療增敏作用的研究〔D〕.長(zhǎng)春：吉林大學(xué),2014.

[4]劉純,張徽,等.凋亡相關(guān)蛋白Fas/FasL和BcL-2在自身免疫性甲狀腺病中的表達(dá)及意義〔J〕.內(nèi)分泌外科,2002,1(1): 9-11.

(本文通訊作者：黃國(guó)良)

(編輯羽飛)

摘要目的：對(duì)他巴唑?qū)谞钕贋V泡細(xì)胞的影響進(jìn)行深入探討和剖析，并對(duì)其作用的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究，以供相關(guān)工作人員借鑒。方法：用不同濃度的他巴唑?qū)ε囵B(yǎng)過(guò)的甲狀腺濾泡細(xì)胞(TFC)在不同作用時(shí)間進(jìn)行比較，另外，用類(lèi)似結(jié)構(gòu)的藥物，比如硫脲、咪唑處理甲狀腺濾泡細(xì)胞,應(yīng)用Annexin-V FITC/PI雙標(biāo)染流式細(xì)胞儀對(duì)甲狀腺濾泡細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比研究他巴唑?qū)谞钕贋V泡細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：不同劑量的他巴唑?qū)谞钕贋V泡細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)有依賴(lài)性，甲狀腺濾泡細(xì)胞數(shù)量的明顯增多就是證明。類(lèi)似藥物中的硫脲對(duì)甲狀腺濾泡細(xì)胞有相似的效果，但是咪唑?qū)谞钕贋V泡細(xì)胞沒(méi)有相關(guān)的效果。結(jié)論：他巴唑增多甲狀腺濾泡細(xì)胞的數(shù)量比率，主要是依賴(lài)硫脲基因產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡作用的。

關(guān)鍵詞他巴唑甲狀腺濾泡細(xì)胞凋亡研究影響 R9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-7585(2015)15-1973-02

Tapazole Influence on Thyroid Follicular Cell Apoptosis

SHI Ying*，ZHOU Xiuwen，LI Hao，et al.*ZhangzhouSinpoHospital,ZhangzhouCity,FujianProvince363000

ABSTRACTObjective: Discuss and analyze the influences of tapazole on thyroid follicular cells (TFC) and study the structure-activity relationship of the influences,so as to provide a certain reference to the related personnel. Methods: Compare TFC cultured with tapazole of varied concentration at different time,treat TFC with drugs of the similar structure,including thiourea,imidazole,test the TFC apoptosis rate with the Annexin-V FITC/PI Dou S-P flow cytometer,and make a comparative research on the influences of tapazole on the TFC apotosis. Results: Tapazole of different dosages has induction and dependence on the TFC apotosis,which is justified by obvious increase of TFC. Thiourea in similar drugs has the similar effect on TFC,but imidazole has not the related effect on TFC. Conclusion: Topazole produces apoptosis effect of induced thyroid filtration cell by increasing the mumber rate of the thyroid filtration cells,aiming at the thioureido group.

KEY WORDSTapazole,Thyroid follicular cell apoptosis,The impact

收稿日期2015-04-10