陳雙璐，于 和

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300074)

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陳雙璐，于 和

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300074)

目的：建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定清化丸中連翹酯苷A和綠原酸含量的方法。方法：色譜柱為Shim-pack VP-ODS C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸(14∶86)；檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm；流速：1.0 ml/min。結(jié)果：連翹酯苷A在0.232～1.856 μg(r=0.999 9)范圍內(nèi)、綠原酸在0.25～2.00 μg(r=0.999 6)范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為97.90%和98.89%；RSD分別為0.317%和0.685%(n=6)。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

清化丸，RP-HPLC法，連翹酯苷A，綠原酸

清化丸是以本院老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)處方為基礎(chǔ)，經(jīng)改良制備工藝后制成的醫(yī)院制劑，由玄參、苦地丁、赤芍、天花粉、連翹、金銀花等10多味中藥組成，具有清熱解毒、軟堅(jiān)消腫的功效，用于治療急性淋巴腺炎、瘡癤化膿性皮膚病。方中金銀花的定量成分為綠原酸，其具有廣泛的抗菌活性，有抗病毒、解熱抗炎的作用[1，2]。連翹的定量成分是連翹酯苷A，其同樣具有很強(qiáng)的抗菌及抗病毒活性[3，4]，臨床上常用連翹治療急性風(fēng)熱感冒、癰腫瘡毒、淋巴結(jié)核等癥。為很好的控制制劑的質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)測(cè)定制劑中連翹酯苷A及綠原酸的含量，方法簡(jiǎn)單、快捷。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津)，紫外檢測(cè)器，LCsolution色譜工作站；雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)110721-200613，供含量測(cè)定用)、連翹酯苷A對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)111810-201103)，乙腈(色譜純，天津市康科德科技有限公司)，磷酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心)，水為純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，其余試劑均為分析純。清化丸(本院自制，批號(hào)為20131201、20140301、20140401)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS (150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸(14∶86)；檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm；柱溫：40 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量10 μl。

2.2 溶液的制備與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品1.25 mg，連翹酯苷A對(duì)照品1.16 mg，置10 ml量瓶中，加70%甲醇至刻度，制成每1 ml中含綠原酸125 μg、連翹酯苷A 116 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取清化丸樣品(20140401)剪碎，取約1 g，精密稱(chēng)定，放入具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇30 ml，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方配比，制備缺金銀花與連翹的清化丸陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下制備方法，制得陰性對(duì)照液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液，分別按照上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明，供試品溶液與對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間處有連翹酯苷A與綠原酸色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在該處未出現(xiàn)色譜峰，對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。理論塔板數(shù)按連翹酯苷A峰與綠原酸峰計(jì)算均大于5 000；分離度符合要求。

1.綠原酸 2.連翹酯苷A

2.3 線性關(guān)系考查 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2.0、6.0、10.0、12.0、14.0和16.0 μl，依次注入高效液相色譜儀，按照上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定連翹酯苷A峰與綠原酸峰面積。分別以各自的進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得連翹酯苷A的回歸方程為：Y=955 918.10X+24 664.71(r=0.999 9)，結(jié)果表明連翹酯苷A進(jìn)樣量在0.232～1.856 μg范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；得綠原酸的回歸方程為：Y=1 518 040.57X+64 214.71(r=0.999 6)，結(jié)果表明綠原酸進(jìn)樣量在0.25～2.00 μg范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液適量，微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液10 μl注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照上述色譜條件分析，測(cè)定峰面積，結(jié)果混合對(duì)照品溶液中連翹酯苷A平均峰面積為1 071 126.2，RSD為0.50%；綠原酸平均峰面積為1 966 308.3，RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批清化丸樣品適量，平行6份，按照文中“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算樣品含量。結(jié)果測(cè)得樣品中連翹酯苷A平均含量為2.189 mg/g，RSD為0.45%；樣品中綠原酸平均含量為1.644 mg/g，RSD為0.70%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批清化丸樣品適量，制成供試品溶液，分別在0、2、4、6和8 h進(jìn)樣測(cè)定連翹酯苷A和綠原酸峰面積，結(jié)果連翹酯苷A平均峰面積為1 499 562.5(RSD為0.37%)，綠原酸平均峰面積為1 955 246.5(RSD為0.13%)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取連翹酯苷A與綠原酸對(duì)照品適量，加70%甲醇制成濃度為0.121 2 mg/ml和0.098 8 mg/ml的混合對(duì)照品溶液；另取已知含量的清化丸適量，約0.5 g，精密稱(chēng)定，共6份，精密加入70%甲醇20 ml，再精密加入上述混合對(duì)照品溶液10 ml，稱(chēng)重，超聲處理30 min，放置至室溫，再稱(chēng)重，加入70%甲醇補(bǔ)足重量，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。連翹酯苷A的平均加樣回收率為97.90%(n=6)，RSD為0.317%；綠原酸的平均加樣回收率為98.89%(n=6)，RSD為0.685%。

表1 連翹酯苷A和綠原酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品測(cè)定結(jié)果 取清化丸3批樣品(批號(hào)為20131201、20140301、20140401)，按上述供試品溶液制備方法操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10 μl，測(cè)得樣品中連翹酯苷A含量分別為：2.346、2.480和2.189 mg/g；樣品中綠原酸含量分別為：1.872、1.813和1.631 mg/g。

3 討論

本文采用等度洗脫的HPLC法測(cè)定制劑中連翹酯苷A與綠原酸的含量，較之梯度洗脫法更簡(jiǎn)單方便，同時(shí)能準(zhǔn)確地測(cè)定兩種有效成分的含量。

選擇提取溶劑時(shí)，比較了50%甲醇、70%甲醇和甲醇，結(jié)果用70%甲醇提取完全；本文比較了超聲與加熱回流兩種提取方式，連翹酯苷A在高溫條件下很不穩(wěn)定，因此選擇了超聲提取方式?？疾榱瞬煌曁崛r(shí)間，結(jié)果30 min與40 min含量一致，故定為30 min。

選擇流動(dòng)相時(shí)，比較了甲醇-磷酸溶液系統(tǒng)與乙腈-磷酸溶液系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-0.2磷酸溶液(14∶86)有效成分的分離效果最好，柱效最高，故選用此系統(tǒng)為測(cè)定的流動(dòng)相。

1 唐敏,劉耀,王渝,等. 金銀花總黃酮粗提物體外抑菌作用研究[J]. 中國(guó)藥房，2008,19(30):2321-2323

2 潘瞾瞾,王雪峰,閆麗娟,等. 金銀花提取物體外抗甲型流感病毒FM1株的研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2007,14(6):37-38

3 李仲興,王秀華,趙建宏，等. 連翹對(duì)金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌的體外抗菌活性研究[J]. 天津中醫(yī)藥,2007,24(4):328-330

4 王四旺,王劍波,王劍波，等. 連翹抗病毒的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2010,7(2):9-10

Determination of forsythoside A ang chlorogenic acid in Qinghua pills by RP-HPLC

Chen Shuanglu ，Yu He

(Tianjin Children Hospital,Tianjin 300074)

Objective: To establish a method for the simultaneous determinationg of forsythoside A and chlorogenic acid in Qinghua pill. Methods: RP-HPLC method was used with Shim-pack VP-ODS C18column(150 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution (14∶86). The flow rate was 1. 0 ml/min. The detection wawelength was at 330 nm. Results: The linear ranges of forsythoside A and chlorogenic acid were 0.232～1.856 μg (r=0.999 9) and 0.25～2.00 μg (r=0.999 6), respectively. The average recoveries were 97.90%(RSD was 0.317%)and 98.89%(RSD was 0.685%), respectively. Conclusion: The method is simple, practicable, accurate, which can be used for the quality control of Qinghua pills.

Qinghua pills,RP- HPLC, forsythoside A, chlorogenic acid

2014-07-01

R927.2

A

1006-5687(2015)01-0010-03