張 琳，曹曉云，袁雯瑋

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

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HPLC梯度洗脫法測定氧氟沙星有關(guān)物質(zhì)的方法研究

張 琳，曹曉云，袁雯瑋

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

目的：建立HPLC梯度洗脫方法同時測定氧氟沙星中的雜質(zhì)A和有關(guān)物質(zhì)。方法：采用反相高效液相色譜法，色譜柱為Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以醋酸銨高氯酸鈉溶液(取醋酸銨4.0 g和高氯酸鈉7.0 g，加水1 300 ml使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.2)-乙腈(85∶15)為流動相A，乙腈為流動相B，進(jìn)行線性梯度洗脫；流速為1 ml/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為238 nm和294 nm。結(jié)果:樣品中各雜質(zhì)峰及主峰的分離度和檢測靈敏度均滿足有關(guān)物質(zhì)的測定要求。結(jié)論:方法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強，可同時測定氧氟沙星的雜質(zhì)A和有關(guān)物質(zhì)。

氧氟沙星，有關(guān)物質(zhì)，雜質(zhì)A，高效液相色譜法，梯度洗脫

氧氟沙星為喹諾酮類抗菌藥，具有廣譜抗菌作用，尤其對需氧革蘭陰性桿菌抗菌活性高。氧氟沙星由日本第一制藥公司在1980年研制成功，1985年4月獲批準(zhǔn)上市。在國內(nèi)，氧氟沙星由浙江新昌制藥廠和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所等單位首先仿制，于1992年6月被批準(zhǔn)上市。

2010年之前《中國藥典》、《歐洲藥典》/《英國藥典》和《美國藥典》均以醋酸銨高氯酸鈉溶液(取醋酸銨4.0 g和高氯酸鈉7.0 g，加水1 300 ml使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.2)-乙腈(85∶15)為流動相系統(tǒng)等度洗脫法檢查氧氟沙星的有關(guān)物質(zhì)， EP/BP在正文后列出了其7個已知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)[1，2]，并采用薄層色譜法檢查雜質(zhì)A，國內(nèi)尚未見相關(guān)的文獻(xiàn)報道。本文參考《中國藥典》2005年版[3]流動相系統(tǒng)，研究建立了測定氧氟沙星有關(guān)物質(zhì)的HPLC梯度洗脫方法，使保留較強的雜質(zhì)A及其他未知雜質(zhì)得到有效洗脫，并確定了更為科學(xué)有效的分離度試驗溶液。

本文建立的方法可在測定氧氟沙星有關(guān)物質(zhì)的同時對雜質(zhì)A進(jìn)行定量檢查，較國內(nèi)外現(xiàn)有的同品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更有優(yōu)勢，已被《中國藥典》2010年版收載。該方法較各國藥典現(xiàn)有方法能更真實、準(zhǔn)確地反映氧氟沙星中有關(guān)物質(zhì)的情況，有助于發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品的質(zhì)量問題，可以更有效地控制生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量的提高。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(DAD檢測器)和島津LC-20A高效液相色譜儀。

1.2 試藥 醋酸銨、高氯酸鈉和磷酸均為分析純，乙腈為色譜純。氧氟沙星對照品(批號130454-200604，HPLC純度98.6%)、氧氟沙星雜質(zhì)A、B、E對照品(雜質(zhì)對照品僅供科研用)和環(huán)丙沙星對照品(批號130451-200302，HPLC純度84.9%，供含量測定用)均由中國藥品生物制品檢定所提供。氧氟沙星(批號0709271、0710191、0712262、OF-M20050705、OF-M20080413和OF-M20080414)及制劑均為國內(nèi)藥廠生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以醋酸銨高氯酸鈉溶液(取醋酸銨4.0 g和高氯酸鈉7.0 g，加水1 300 ml使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.2)-乙腈(85∶15)為流動相A，乙腈為流動相B，線性梯度洗脫，時間程序見表1。流速為1 ml/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為238 nm和294 nm。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2．2．1 供試品溶液 取本品適量，用0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml中約含1.2 mg的溶液。

2． 2.2 對照溶液 精密稱取氧氟沙星對照品適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1 ml中含2.4 μg的溶液。

2.2.3 雜質(zhì)A對照品溶液 精密稱取雜質(zhì)A對照品約12 mg，置100 ml量瓶中，用6 mol/L氨溶液0.6 ml與水適量使溶解，并用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 ml，置100 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)A對照品溶液，用于雜質(zhì)A定量。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 稱取氧氟沙星對照品、環(huán)丙沙星對照品和雜質(zhì)E對照品各適量，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1 ml含氧氟沙星1.2 mg、環(huán)丙沙星和雜質(zhì)E各6 μg的混合溶液。取10 μl注入液相色譜儀，在 294 nm波長下記錄色譜圖，氧氟沙星峰的保留時間約為15 min，氧氟沙星峰與雜質(zhì)E峰和環(huán)丙沙星峰間的分離度均應(yīng)不小2.0，見圖1。

1.雜質(zhì)B 2.雜質(zhì)E 3.氧氟沙星4.環(huán)丙沙星 5.雜質(zhì)A 6.雜質(zhì)1 7.雜質(zhì)2

2.4 專屬性試驗 取氧氟沙星原料，分別經(jīng)酸、堿、光、氧化和熱破壞后，在238 nm和294 nm進(jìn)樣測試。結(jié)果表明，在各種破壞條件下所得的降解產(chǎn)物與主成分峰分離良好，降解產(chǎn)物峰之間也均能達(dá)到基線分離，該方法專屬性好，結(jié)果見圖2。

2.5 線性關(guān)系考查 取氧氟沙星和雜質(zhì)A對照品各適量，分別制成每1 ml中約含0.06 mg的儲備溶液，精密量取儲備溶液各0.5、1、2、5和10 ml置50 ml量瓶中，制成系列濃度的溶液，進(jìn)樣測試，考查氧氟沙星(294 nm檢測)和雜質(zhì)A(238 nm檢測)的線性關(guān)系。結(jié)果表明，在294 nm檢測，氧氟沙星溶液濃度在0.6～30 μg/ml范圍內(nèi)，峰面積與濃度均呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=5.557 8×104X+3.984 2×102(r=1.000 0)；在238 nm檢測，雜質(zhì)A溶液濃度在0.6～30 μg/ml范圍內(nèi)，峰面積與濃度均呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=5.528 9×104X+2.460 2×103(r=1.000 0)。

2． 6 檢出限 在238 nm檢測，雜質(zhì)A最低檢出濃度為0.048 μg/ml(相當(dāng)于供試品溶液的0.004%)；在294 nm檢測，雜質(zhì)B最低檢出濃度為0.012 μg/ml(相當(dāng)于供試品溶液的0.001%)，雜質(zhì)E最低檢出濃度為0.024 μg/ml(相當(dāng)于供試品溶液的0.002%)，氧氟沙星最低檢出濃度為0.024 μg/ml(相當(dāng)于供試品溶液的0.002%)。

2． 7 溶液的穩(wěn)定性 氧氟沙星供試品溶液室溫條件下放置0、1、2、4和8 h時，分別進(jìn)樣測試，以峰面積計算，雜質(zhì)A、最大單一雜質(zhì)和總雜質(zhì)的RSD分別為0.5%、1.2%和1.0%(n=5)。表明供試品溶液室溫條件下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2． 8 供試品溶液濃度與有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果的相關(guān)性 取氧氟沙星樣品，分別制成濃度為0.96、1.2和1.44 mg/ml的供試品溶液和相應(yīng)的0.2%的自身對照溶液。分別依法測定，以峰面積計算，雜質(zhì)A、最大單一雜質(zhì)和總雜質(zhì)的RSD分別為1.5%、1.3%和0.8%。表明供試品溶液在0.96～1.44 mg/ml濃度范圍內(nèi)，有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果與溶液濃度有良好的相關(guān)性。

2．9 方法耐用性 采用①Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、②Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6mm 5μm)、③菲羅門 luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和④SGE C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)4根不同色譜柱考查分離度測試溶液，主峰與雜質(zhì)E峰和環(huán)丙沙星峰間的分離度均不低于2.0。采用條件①Agilent 1200高效液相色譜儀，Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱和條件②島津LC-20A高效液相色譜儀，Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)同時考查相同2批樣品的有關(guān)物質(zhì)，測定結(jié)果基本一致。上述試驗結(jié)果表明該方法耐用性良好。

2． 10 樣品的測定結(jié)果 對2個生產(chǎn)廠家提供的6批氧氟沙星原料采用以上方法測定有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見表2。

2． 11 有關(guān)物質(zhì)限度的確定 本方法采用雜質(zhì)對照品外標(biāo)法對雜質(zhì)A進(jìn)行定量；對于除雜質(zhì)A外其他雜質(zhì)，采用不加校正因子的主成分自身對照法測定，與EP和BP一致。由于采用HPLC梯度洗脫法，本法較同品種其他質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多檢出雜質(zhì)A和一較大的未知雜質(zhì)，根據(jù)樣品的測定結(jié)果及EP對雜質(zhì)A所規(guī)定的限度，本方法限度規(guī)定見表3。

1.氧氟沙星

表3 有關(guān)物質(zhì)限度表

3 討論

3.1 關(guān)于系統(tǒng)適用性試驗 《歐洲藥典》/《英國藥典》及《中國藥典》2005年版系統(tǒng)適用性溶液均限定氧氟沙星峰與雜質(zhì)E峰(相對保留時間約為0.9)的分離度，未對主峰后緊鄰雜質(zhì)的分離加以控制。而圖2供試品溶液色譜圖中標(biāo)示的未知雜質(zhì)“雜質(zhì)1”在部分氧氟沙星原料及制劑中均可檢出，最高可達(dá)0.25%，因此對氧氟沙星與其后雜質(zhì)的分離度加以限定是必要的。對不含雜質(zhì)1的樣品進(jìn)行各種強制破壞后均未得到主峰后緊鄰的雜質(zhì)；以梯度洗脫系統(tǒng)考查環(huán)丙沙星、諾氟沙星等十幾種同類物質(zhì)，得到環(huán)丙沙星峰與氧氟沙星峰的相對保留時間約為1.1，與雜質(zhì)1的保留時間最為接近。因此規(guī)定以氧氟沙星與雜質(zhì)E(相對保留時間0.9)和環(huán)丙沙星(相對保留時間1.1)進(jìn)行系統(tǒng)適用性分離度的試驗，分離度均不低于2.0，可保證主峰與其前后相鄰雜質(zhì)峰有效分離。

3.2 檢測波長的選擇 《中國藥典》2005年版、《歐洲藥典》/《英國藥典》均采用294 nm作為檢測波長。經(jīng)DAD試驗結(jié)果表明，氧氟沙星和雜質(zhì)A分別在294 nm和238 nm處有最大吸收，雜質(zhì)E、雜質(zhì)1和雜質(zhì)2最大吸收波長均在294 nm附近；故本方法選擇在238 nm波長處檢查雜質(zhì)A，在294 nm波長處檢查其他雜質(zhì)。

3.3 氧氟沙星制劑的測定 有關(guān)物質(zhì)測定方法的關(guān)注點在于方法的靈敏度和專屬性，即雜質(zhì)被有效地檢出。本文采用梯度洗脫的方法，不僅能將保留較強的雜質(zhì)A洗脫，還可檢出更多未知雜質(zhì)，更能體現(xiàn)樣品的真實情況；采用294 nm和238 nm雙波長檢測還可同時對雜質(zhì)A進(jìn)行定量，較薄層色譜法更為準(zhǔn)確。采用本文方法分析不同企業(yè)生產(chǎn)的氧氟沙星片、膠囊、注射液和滴眼液等制劑，輔料均無干擾，因此本方法可同時用于氧氟沙星系列制劑的有關(guān)物質(zhì)(包括雜質(zhì)A)測定。

1 European Pharmacopoeia 6.0[S].2007：2541-2542

2 The British Pharmacopoeia 2009[S]. 2008：1578-1579

3 中國藥典[S].二部.2005：605

Determination of related substances of ofloxacin by gradient elution HPLC

Zhang Lin,Cao Xiaoyun,Yuan Wenwei

(Tianjin Institute for Drug Control,Tianjin 300070)

Objective:To establish a method for the determination of impurity A and related substances of ofloxacin by gradient elution HPLC. Methods ：The separation was performed on a Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm ,5 μm) column. Ammonium acetate and sodium perchlorate solution(dissolve 4.0 g of ammonium acetate and 7.0g of sodium perchlorate in 1 300 ml of water, adjusted to pH 2.2 by phosphoric acid) -acetonitrile(85∶15) as mobile phase A, acetonitrile as mobile phase B.The flow rate was 1 ml/min, the column temperature was 40 ℃， detective wavelength was 238 nm and 294 nm. Results： The resolution and sensitivity of related substances were acceptable. Conclustion： The method is sensitive,accurate and specific and can be used for the determination of impurity A and the related substances of ofloxacin.

ofloxacin，related substances，impurity A,HPLC,gradient elution

2014-04-21

R927.11

A

1006-5687(2015)01-0005-05