周夫群，黃章騫，何 堯

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·論著·

bcl-2小分子干擾RNA對人子宮內膜癌RL-952細胞阿霉素敏感性的影響

周夫群，黃章騫，何 堯

目的 研究靶向bcl-2小分子干擾RNA(siRNA)干擾序列對人子宮內膜癌RL-952細胞阿霉素(DOX)敏感性的影響及相關作用機制。方法 2014年5—8月，將siRNA干擾序列轉染人子宮內膜癌RL-952細胞，設3個實驗組：空白對照組、bcl-2 siRNA干擾組(轉染bcl-2 siRNA干擾序列)及陰性對照組(轉染siRNA空載序列)，檢測bcl-2 siRNA干擾組的轉染效率和3組bcl-2表達水平。將細胞隨機分成5組，分別為空白對照組、陰性對照組(轉染siRNA空載序列)、干擾組(轉染bcl-2 siRNA干擾序列)、DOX組(加入5 μg/ml DOX)、聯合組(轉染siRNA干擾序列并加入5 μg/ml DOX)，檢測細胞活力、細胞凋亡率、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9活性及細胞色素C水平。結果 siRNA干擾序列轉染人子宮內膜癌RL-952細胞的轉染效率為(94.6±12.5)%。3組bcl-2表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=8.75，P<0.05)。bcl-2 siRNA干擾組bcl-2表達水平低于空白對照組和陰性對照組(q=3.99、2.87，P<0.01)。5組細胞活力比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=42.52，P<0.05)。干擾組、DOX組、聯合組細胞活力低于空白對照組(q=7.66、8.64、6.89，P<0.05)；聯合組細胞活力低于DOX組(q=6.76，P<0.01)。5組細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=112.34，P<0.05)。干擾組、DOX組、聯合組細胞凋亡率高于空白對照組(q=5.78、4.99、6.21，P<0.05)；聯合組細胞凋亡率高于DOX組(q=4.89，P<0.01)。5組Caspase-3、Caspase-9活性及細胞色素C水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。干擾組、DOX組、聯合組Caspase-3、Caspase-9活性及細胞色素C水平高于空白對照組(P<0.05)；DOX組、聯合組Caspase-3活性高于陰性對照組，干擾組、DOX組、聯合組Caspase-9活性高于陰性對照組(P<0.05)；聯合組Caspase-3活性高于干擾組，DOX組、聯合組Caspase-9活性高于干擾組(P<0.05)；聯合組Caspase-3、Caspase-9活性及細胞色素C水平高于DOX組(P<0.05)。結論 靶向bcl-2 siRNA干擾序列可以增強人子宮內膜癌RL-952細胞的DOX敏感性，bcl-2可作為人子宮內膜癌基因治療的候選靶點。

子宮內膜腫瘤；基因,bcl-2；RNA,小分子干擾；阿霉素；半胱氨酸蛋白酶類

周夫群，黃章騫，何堯.bcl-2小分子干擾RNA對人子宮內膜癌RL-952細胞阿霉素敏感性的影響[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(24)：2917-2921.[www.chinagp.net]

Zhou FQ,Huang ZQ,He Y.Influence of bcl-2 small interference RNA on the sensibility of endometrial carcinoma RL-952 cells to doxorubicin[J].Chinese General Practice，2015，18(24)：2917-2921.

子宮內膜癌(endometrial carcinoma)是發(fā)生于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，好發(fā)于圍絕經期和絕經后女性。子宮內膜癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤之一，每年有接近20萬的新發(fā)病例，是導致死亡的第3位常見婦科惡性腫瘤(僅次于卵巢癌和宮頸癌)[1-2]。目前，我國已進入了老齡化社會，隨著老年人口數量的增加，子宮內膜癌患者中老年人比例也隨之增加。由于老年患者多伴有并發(fā)癥，加之一些重要器官如：肝臟、腎臟、骨髓生理功能減弱，進而耐受放療、化療的能力也隨之減弱，因此，開辟新的治療途徑迫在眉睫。

小分子干擾RNA(small interference RNA，siRNA)技術是近年來發(fā)展的一種特異性抑制基因表達的新方法，通過具有同源性的雙鏈RNA(dsRNA)迅速阻斷mRNA表達活性，誘導序列特異的靶基因沉默，是分子生物學實驗室中一種強大的實驗工具[3-5]。本研究通過siRNA技術抑制人子宮內膜癌RL-952細胞中bcl-2基因的表達，同時聯合化療藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)，以觀察其聯合作用對人子宮內膜癌RL-952細胞活力及凋亡的影響，初步探討相關作用機制，為臨床治療子宮內膜癌提供理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株和試劑 人子宮內膜癌細胞株RL-952購買于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和RPMI 1640培養(yǎng)基購自HyClone公司。DOX購自武漢三洹醫(yī)藥化工有限公司。bcl-2 siRNA干擾序列及轉染試劑盒由上海吉凱基因化學技術有限公司設計并合成。細胞裂解液、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9和細胞色素C活性檢測試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。BCA蛋白定量試劑盒、鼠抗人β-actin一抗、鼠抗人bcl-2一抗和羊抗鼠二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。四甲基氮唑藍(methylthiaLzolyItetraLzolium，MTT)粉末購自美國Sigma-Aldrich公司。脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 2014年5—8月，人子宮內膜癌RL-952細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，經0.25%胰蛋白酶消化傳代后置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天傳代。

1.2.2 siRNA干擾序列轉染人子宮內膜癌RL-952細胞并檢測轉染效率 將對數生長期的人子宮內膜癌RL-952細胞制備成單細胞懸液(3.0×105/ml)接種在6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2.0 ml細胞懸液，待細胞貼壁后，參照脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000說明書進行siRNA干擾序列轉染操作。設3個實驗組：空白對照組、bcl-2 siRNA干擾組(轉染bcl-2 siRNA干擾序列)及陰性對照組(轉染siRNA空載序列)。孵育4 h后更換常規(guī)新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20 h，收集細胞驗證bcl-2 siRNA干擾組轉染效率。

1.2.3 檢測bcl-2表達水平 用2 ml預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)淋洗3組細胞后，每孔加入500 μl細胞裂解液，按照說明書步驟提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒調整蛋白水平，制作聚丙烯酰胺濃縮膠和分離膠，每組取40 μg蛋白樣品進行電泳，經轉膜、封閉、一抗(鼠抗人β-actin一抗、鼠抗人bcl-2一抗)和二抗(羊抗鼠二抗)孵育和洗滌(一抗稀釋比為1∶500；二抗稀釋比為1∶3 000)。ECL顯色后，經全自動電泳凝膠分析系統(tǒng)掃描曝光并通過Gene Tool軟件分析各組bcl-2表達水平。

1.2.4 檢測細胞活力 將對數生長期的人子宮內膜癌RL-952細胞制備單細胞懸液，以每孔5.0×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中。隨機分成5組，分別為空白對照組、陰性對照組(轉染siRNA空載序列)、干擾組(轉染bcl-2 siRNA干擾序列)、DOX組(加入5 μg/ml DOX)、聯合組(轉染siRNA干擾序列并加入5 μg/ml DOX)，每組設8個復孔，DOX濃度參照本實驗室前期預實驗結果。處理24 h后，2 000 r/min離心10 min(離心半徑3 cm)，棄上清液，每孔加入100 μl MTT溶液(終濃度為0.05 mg/ml)，37 ℃避光繼續(xù)孵育4 h，2 000 r/min離心10 min(離心半徑3 cm)，棄上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解結晶，酶標儀讀取吸光度(A540值)。

1.2.5 檢測細胞凋亡率 將對數生長期的人子宮內膜癌RL-952細胞制備成單細胞懸液，以每孔6.0×105個細胞接種于6孔培養(yǎng)板中。分組方法同上，人子宮內膜癌RL-952細胞按細胞活力檢測方法處理24 h后，預冷PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化，以1 500 r/min離心10 min(離心半徑3 cm)，收集細胞，制備成濃度為5.0×106/ml的單細胞懸液；取100 μl細胞懸液，加入400 μl 1×Binding Buffer重懸細胞，分別加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI溶液混勻，室溫避光孵育20 min，流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.2.6 檢測Caspase-3、Caspase-9活性及細胞色素C水平 將對數生長期的人子宮內膜癌RL-952細胞制備單細胞懸液，將2.0×107個細胞接種于25 ml細胞培養(yǎng)瓶中。分組方法同上，人子宮內膜癌RL-952細胞按細胞活力檢測方法處理24 h后，制備成單細胞懸液，調整細胞濃度至1.0×107/ml，每107個細胞加入1 ml細胞裂解液，參照試劑盒方法分別提取總蛋白和胞質蛋白，其中，總蛋白用于檢測Caspase-3、Caspase-9活性，胞質蛋白用于檢測胞質細胞色素C水平，檢測步驟按ELISA試劑盒操作說明書進行。

2 結果

2.1 轉染效率 bcl-2 siRNA干擾序列轉染人子宮內膜癌RL-952細胞的轉染效率為(94.6±12.5)%。

2.2 bcl-2表達水平比較 空白對照組bcl-2表達水平為(1.109±0.002)，bcl-2 siRNA干擾組為(0.447±0.001)，陰性對照組為(1.126±0.004)。各組bcl-2 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=8.75，P<0.05)。bcl-2 siRNA干擾組bcl-2 表達水平低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(q=3.99、2.87，P<0.01，見圖1)。

注：siRNA=小分子干擾RNA

圖1 bcl-2表達水平

Figure 1 Expression level of bcl-2

2.3 細胞活力比較 空白對照組細胞活力為(100.0±0.2)%，陰性對照組為(99.5±1.8)%，干擾組為(83.0±3.6)%，DOX組為(79.0±0.7)%，聯合組為(63.0±1.6)%。5組細胞活力比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=42.52，P<0.05)。干擾組、DOX組、聯合組細胞活力低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(q=7.66、8.64、6.89，P<0.05)；聯合組細胞活力低于DOX組，差異有統(tǒng)計學意義(q=6.76，P<0.01)。

2.4 細胞凋亡率比較 空白對照組細胞凋亡率為(2.3±0.2)%，陰性對照組為(3.4±0.4)%，干擾組為(18.4±1.2)%，DOX組為(22.3±4.2)%，聯合組為(39.2±3.7)%。5組細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=112.34，P<0.05)。干擾組、DOX組、聯合組細胞凋亡率高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(q=5.78、4.99、6.21，P<0.05)；聯合組細胞凋亡率高于DOX組，差異有統(tǒng)計學意義(q=4.89，P<0.01)。

2.5 Caspase-3、Caspase-9活性及細胞色素C水平比較 各組Caspase-3、Caspase-9活性及細胞色素C水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。干擾組、DOX組、聯合組Caspase-3、Caspase-9活性及細胞色素C水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DOX組、聯合組Caspase-3活性高于陰性對照組，干擾組、DOX組、聯合組Caspase-9活性高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；聯合組Caspase-3活性高于干擾組，DOX組、聯合組Caspase-9活性高于干擾組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；聯合組Caspase-3、Caspase-9活性及細胞色素C水平高于DOX組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level among different groups

組別Caspase-3(μmolpNA/109cell)Caspase-9(μmolpNA/109cell)細胞色素C(μmol/mg)空白對照組4.14±2.973.12±1.270.13±0.06陰性對照組5.68±1.084.27±1.990.18±0.01干擾組9.25±1.54b8.25±1.25bc3.61±1.42bDOX組12.53±3.12bc10.97±2.02bcd5.33±2.00b聯合組21.45±4.22bcde15.65±2.24bcde10.13±2.54beF(u)值35.5648.1010.60aP值0.0430.0380.029

注：a為u值；與空白對照組比較，bP<0.05；與陰性對照組比較，cP<0.05；與干擾組比較，dP<0.05；與DOX組比較，eP<0.05；Caspase=半胱氨酸蛋白酶

3 討論

細胞凋亡是一種細胞自發(fā)的生理性死亡，與病理性細胞壞死不同，凋亡是由多基因精確調控的過程，對多細胞有機體的正常發(fā)育和自身穩(wěn)定具有極其重要的生物學作用，細胞凋亡失衡與許多疾病尤其是與腫瘤的發(fā)生相關聯[6]。研究表明，細胞凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起負調控作用，凋亡受抑制，最終可能導致細胞癌變或腫瘤，而過度凋亡則與神經退行性疾病等有關[3，7-8]。bcl-2基因家族是目前廣泛研究的一類細胞凋亡基因，其表達和調控是影響細胞凋亡的關鍵因素之一。根據其對細胞凋亡的作用特點，可將bcl-2家族分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，其中，促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白之間的比例決定著細胞對各種凋亡因素(如化療藥物)的敏感性[9-10]。DNA損傷類化療藥物可通過上調凋亡相關基因(Bax)/bcl-2來改變線粒體外膜完整性，誘發(fā)線粒體膜通道開放，導致細胞色素C等細胞凋亡執(zhí)行因子釋放入胞質，從而啟動腫瘤細胞凋亡過程。雖然放療和化療均可通過誘導腫瘤細胞凋亡來發(fā)揮抗癌作用，但腫瘤組織中常會出現耐受細胞群，引起化療和放療的治療效率降低，并最終導致惡性腫瘤復發(fā)和浸潤轉移[11-12]。因此，開發(fā)靶向抗凋亡蛋白bcl-2的化療藥物是當前研究抗腫瘤藥物的熱點。本研究以人子宮內膜癌RL-952細胞為研究對象，觀察靶向bcl-2 siRNA干擾序列聯合DOX處理對人子宮內膜癌RL-952細胞增殖的抑制作用，驗證通過醫(yī)療手段抑制bcl-2在子宮內膜癌治療中的作用及可行性。

本研究結果顯示，siRNA干擾序列轉染人子宮內膜癌RL-952細胞的轉染效率為(94.6±12.5)%，提示轉染成功。干擾組、DOX組、聯合組細胞活力低于空白對照組；聯合組細胞活力低于DOX組。提示在本實驗體系中，靶向bcl-2 siRNA干擾序列轉染和DOX處理兩者聯合作用在抑制人子宮內膜癌RL-952細胞增殖上有明顯的協(xié)同效果。Caspase家族是哺乳動物細胞中程序性死亡(PCD)的主要介導者和執(zhí)行者，包括以Caspase-9為代表的凋亡啟動因子和Caspase-3為代表的凋亡執(zhí)行因子，當細胞接受凋亡信號后，Caspases家族成員可被級聯激活，其中Caspase-9位于級聯反應最上游，可在其他協(xié)同因子參與下發(fā)生自我活化并激活下游凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，后者則作用于特異性底物使細胞發(fā)生一系列生化及形態(tài)學改變，最終導致細胞凋亡[13-16]。線粒體細胞色素C的釋放是線粒體依賴性細胞凋亡的標志事件[17]。本研究結果顯示，bcl-2 siRNA干擾組bcl-2 表達水平低于空白對照組和陰性對照組；干擾組、DOX組、聯合組細胞凋亡率高于空白對照組；聯合組細胞凋亡率高于DOX組；干擾組、DOX組、聯合組Caspase-3、Caspase-9活性及細胞色素C水平高于空白對照組，DOX組、聯合組Caspase-3活性高于陰性對照組，干擾組、DOX組、聯合組Caspase-9活性高于陰性對照組，聯合組Caspase-3活性高于干擾組，DOX組、聯合組Caspase-9活性高于干擾組，聯合組Caspase-3、Caspase-9活性及細胞色素C水平高于DOX組。提示在本實驗體系中，線粒體在bcl-2沉默對人子宮內膜癌RL-952細胞凋亡的促進作用中發(fā)揮了關鍵作用。但由于癌細胞基因突變的多樣性，靶向bcl-2 siRNA干擾序列在其他癌細胞中的作用仍有待進一步研究。

綜上所述，靶向bcl-2 siRNA干擾序列可以有效增強子宮內膜癌RL-952細胞對化療藥物DOX的敏感性。因此，bcl-2基因沉默結合傳統(tǒng)DOX化療可能在人子宮內膜癌的治療中具有廣泛的應用前景。隨著siRNA相關技術研究的深入，siRNA藥物在不久后將會進行臨床試驗，從而給腫瘤的臨床治療開辟一條新的途徑。

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(本文編輯：崔麗紅)

Influence of bcl-2 Small Interference RNA on the Sensibility of Endometrial Carcinoma RL-952 Cells to Doxorubicin

ZHOUFu-qun,HUANGZhang-qian,HEYao.

DepartmentofGynaecologyandObstetrics,ShaoxingWomen&Children′sHospital,Shaoxing312000,China

Objective To research the influence of bcl-2 targeting siRNA on the sensibility of endometrial carcinoma RL-952 cells to doxorubicin (DOX).Methods From May to August in 2014,siRNA interference sequence were transfected into endometrial carcinoma RL-952 cells.The RL-952 cells were divided into three trial groups: blank control group,bcl-2 siRNA interference group (with transfected bcl-2 siRNA interference sequence) and negative control group (with transfected siRNA empty sequence).The transfection efficiency of bcl-2 siRNA interference group and the protein expression level of bcl-2 of the three groups were tested.The RL-952 cells were divided into five groups: control blank group,negative control group (with transfected siRNA empty sequence),interference group (with transfected bcl-2 siRNA interference sequence),DOC group (added with 5 μg/ml DOX),and combination group (with transfected siRNA interference sequence and 5 μg/ml DOX).Cell viability,cell apoptosis rate,the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level of the five groups were tested.Results The efficiency of transfection from siRNA interference sequence to endometrial carcinoma RL-952 cells was (94.6±12.5)%.The three trial groups were significantly different in the protein expression level of bcl-2 (F=8.75,P<0.05).The bcl-2 siRNA interference group was lower than blank control group and negative control group in the protein expression level (q=3.99,2.87;P<0.01).The five groups were significantly different in cell viability (F=42.52,P<0.05).Interference group,DOC group and combination group were lower than blank control group in cell viability (q=7.66,8.64,6.89;P<0.05);combination group was lower than DOX group in cell viability (q=6.76,P<0.01).The five groups were significantly different in cell apoptosis rate (F=112.34,P<0.05).Interference group,DOX group and combination group were higher than blank control group in cell apoptosis rate (q=5.78,4.99,6.21;P<0.05);combination group was higher than DOX group in cell apoptosis rate (q=4.89,P<0.01).The five groups were significantly different in the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level (P<0.05).Interference group,DOX group and combination group were higher than the blank control group in the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level (P<0.05);DOX group,and combination group were higher than negative control group in the activity of Caspase-3 (P<0.05),and interference group,DOX group and combination group were higher than negative control gorup in the activity of Caspase-9 (P<0.05);combination group was higher than interference group in the activity of Caspase-3 (P<0.05),and DOX group and combination group were higher than interference group in the activity of Caspase-9 (P<0.05);combination group was higher than DOX group in the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level (P<0.05).Conclusion bcl-2 targeting siRNA interference sequence can increase the sensitivity of endometrial carcinoma RL-952 cells to DOX.bcl-2 gene may be a potential target in the gene therapy of endometrial carcinoma.

Endometrial neoplasms;Genes,bcl-2;RNA,small interfering;Doxorubicin;Cysteine proteases

312000 浙江省紹興市婦幼保健院婦產科

周夫群，312000 浙江省紹興市婦幼保健院婦產科；E-mail：zfqyst@163.com

R 737.33

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.010

2014-09-30；

2015-03-25)