腎穿刺活檢病理PASM染色方法改良探討

曲樂1，劉樹軍1，徐進(jìn)2，高丹1，婁巖1*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 腎病內(nèi)科,吉林 長春130041；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院 電鏡室)

目前腎穿刺活檢是腎病內(nèi)科診斷腎臟疾病的主要方法[1-3]。在腎穿刺活檢病理診斷中，顯示腎小球基底膜病變及免疫復(fù)合物定位主要采用PASM (Periodic Acid-SilverMethenamine) 染色法。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的PASM染色法染色效果不佳，不能顯示免疫復(fù)合物沉積的情況，基底膜顯色較重，背景較深，染色時(shí)間過長，并且常有雜質(zhì)粘附于組織表面，影響臨床病理診斷。針對(duì)以上問題，本實(shí)驗(yàn)對(duì)染液的配制方法、染色條件及切片的厚度進(jìn)行了調(diào)整?？偨Y(jié)出配方合理、染色穩(wěn)定和可重復(fù)性強(qiáng)的染色方法。

1材料與方法

1.1標(biāo)本處理與分組隨機(jī)選取吉林大學(xué)第二醫(yī)院腎病內(nèi)科腎穿刺活檢組織標(biāo)本256例，經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定24 h，組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，切片厚度為1 μm，63℃烤片4.5 h。將標(biāo)本隨機(jī)分為兩組，每組為128例，分別用傳統(tǒng)PASM染色方法和改良PASM染色方法染色，在同一時(shí)間，同一環(huán)境下進(jìn)行染色，染色結(jié)果由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師采用雙盲進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2染液配置方法

1.2.1傳統(tǒng)六氨銀溶液配制方法3%六次甲基四胺水溶液25 ml，加入5%硝酸銀水溶液2.5 ml，震蕩至乳白色懸濁液變?yōu)榍辶镣该鳎尤?%四硼酸鈉5 ml，加入22.5 ml蒸餾水，最后加入4%硼酸7滴，混勻后過濾立即使用，如果不立即使用放入4℃冰箱避光儲(chǔ)存。

1.2.2改良六氨銀溶液配制方法3%六次甲基四胺水溶液25 ml，加入2%四硼酸鈉5 ml，加入5%硝酸銀水溶液2.5 ml，震蕩至乳白色懸濁液變?yōu)榍辶镣该?，加?0 ml蒸餾水，最后加入4%硼酸5滴，混勻后過濾立即使用，如果不立即使用放入4℃冰箱避光儲(chǔ)存。

1.2.3Masson染液配制方法3.2 g磷鎢酸、4 ml冰醋酸、2.4 g變色酸2R及1.5 g亮綠，依次逐一加入400 ml的蒸餾水中，混勻后備用。

1.3PASM染色方法1μm組織切片脫蠟至水；1%過碘酸氧化5 min；蒸餾水沖洗2 min；置切片于新鮮配制的六氨銀作液中，于65℃溫箱中加溫20-30 min肉眼見切片呈褐黃色，鏡下見腎小球基底膜呈黑色為止；根據(jù)銀染情況選擇性的用0.1%氯化金分化，3%硫代硫酸鈉定影15 s，蒸餾水洗2 min；經(jīng)蘇木精染核5-6 min，蒸餾水沖洗2 min；1%鹽酸酒精水溶液分化數(shù)秒，自來水洗2min；弱氨水返蘭數(shù)秒；Masson染液套染數(shù)秒，鏡下觀察染色情況適時(shí)終止； 高濃度梯度酒精脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組PASM染色制片質(zhì)量情況評(píng)價(jià)128例標(biāo)本經(jīng)改良PASM染色，其中2例染色過度，3例染色過淺，1例多余銀顆粒雜質(zhì)沉積，共計(jì)6例制片質(zhì)量不合格，制片質(zhì)量合格率為95.31%。128例標(biāo)本經(jīng)傳統(tǒng)PASM染色，33例染色過度，1例染色過淺，25例含有多余銀顆粒沉積，59例制片質(zhì)量不合格，制片質(zhì)量合格率為61.72%，在銀染過度和多余銀顆粒雜質(zhì)沉積兩項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)中，改良PASM染色法制片質(zhì)量優(yōu)于傳統(tǒng)PASM染色法，其中銀染過淺評(píng)價(jià)指標(biāo)中顯示兩種方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，銀染過淺情況發(fā)生率極低(見表1)，造成銀染過淺的原因除了時(shí)間的因素外，是否與試劑的批號(hào)有關(guān)需做進(jìn)一步研究。

表1　兩組PASM染色制片質(zhì)量情況評(píng)價(jià)(例數(shù))

2.2腎組織石蠟切片的改良PASM染色方法和傳統(tǒng)PASM染色方法染色效果比較改良PASM染色結(jié)果顯示基底膜、網(wǎng)狀纖維、IV型膠原呈黑色，且“勾勒”清晰，免疫復(fù)合物呈紅色，細(xì)胞核為呈藍(lán)色，背景呈粉紅色、清晰無雜質(zhì)(圖1-A)，而傳統(tǒng)的PASM染色結(jié)果常使示基底膜六氨銀染色過深或過淺，易產(chǎn)生細(xì)胞增生和基底膜增厚的假象，并且背景易出現(xiàn)銀顆粒雜質(zhì)(圖1-B、圖1-C)，不能真實(shí)反映出腎臟的病理變化，不利于臨床診斷。

A：染色適中；B：染色過深：C：染色過淺且有銀顆粒雜質(zhì)

3討論

PASM染色的基本原理是腎小球基底膜和系膜區(qū)等部位的蛋白多糖被1%過碘酸氧化后暴露出醛基，醛基再與六氨銀染液中銀離子發(fā)生銀鏡反應(yīng)，然后再套以Masson三色染色，染色結(jié)果能夠清晰地顯示基底膜、系膜的病變和免疫復(fù)合物沉積的情況[4]。腎臟疾病常導(dǎo)致基底膜和系膜區(qū)的改變，所以PASM染色質(zhì)量的好壞對(duì)臨床診斷有很大影響[5]。

在臨床工作中發(fā)現(xiàn)PASM染色受很多因素的影響。與傳統(tǒng)PASM染色方法相比，改良PASM染色方法降低了六氨銀溶液的硝酸銀、硼酸濃度，使得切片組織在銀染時(shí)更溫和，著色更適度，更易于控制，不至于出現(xiàn)染色過深、染色過淺及多余銀顆粒沉積的現(xiàn)象。同時(shí)，改良的PASM染色方法調(diào)整六氨銀溶液的配制順序，先將硼砂加入六次甲基四胺中，使溶液堿化后再加入硝酸銀，因?yàn)閴A化的六次甲基四胺硼砂液削弱六次甲基四胺鰲合銀離子的穩(wěn)定性，使銀離子極易被游離的醛基還原成棕黑色的沉淀[6]，與傳統(tǒng)PASM染色方法相比，改良PASM染色方法較快，而且穩(wěn)定，適用于臨床推廣。

對(duì)于改良PASM染色方法中出現(xiàn)極少數(shù)銀染過度、銀染過淺的情況，在工作中還應(yīng)注意以下重要6點(diǎn)：1)充分氧化組織：腎組織切片需用1%過碘酸充分氧化，保證蛋白多糖充分暴露醛基，進(jìn)而能夠與銀離子充分結(jié)合。2)孵育溫度：孵育溫度是PASM染色最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)摸索，孵育溫度控制在65℃左右，銀染效果最佳，溫度偏低標(biāo)本不宜著色，病理玻片會(huì)出現(xiàn)多余銀顆粒沉積；溫度偏高則容易導(dǎo)致標(biāo)本著色過度。3)染液中銀離子濃度：硝酸銀濃度要適中，如果硝酸銀濃度過高不利于染色的控制；硝酸銀濃度過低容易使六氨銀溶液變渾濁，并出現(xiàn)氯化金難以去除的黑色反光膜[4]，致使切片背景較臟不利于診斷。4)孵育時(shí)間：切片1 μm厚度，一般在改良的六氨銀染液孵育時(shí)間為30 min左右，在孵育的過程中及時(shí)觀察，根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)適時(shí)終止孵育，然后根據(jù)銀染情況選擇性的用0.1%氯化金分化，以求達(dá)到最佳效果。5)所用配液器皿必須保證清潔，無雜質(zhì)，配液之前充分刷洗，并用蒸餾水沖洗2-3 min。6)為保證配制的試劑染色效果良好、延長試劑使用期限，所用試劑均放在4℃冰箱冷貯。

總之，改良PASM染色能夠收到良好的染色效果，并適合在臨床應(yīng)用推廣。但同時(shí)要控制切片組織的氧化、孵育溫度和孵育時(shí)間等因素，才能避免極少數(shù)病例銀染過度、過淺和多余銀雜質(zhì)顆粒沉積等問題。

參考文獻(xiàn)：

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[5]呂增華，張楊楊，朱玉紅．腎穿刺活檢六胺銀染色套染 Masson 染色方法的改良[J]．臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2012,28(12):1289.

[6]李繼承主編．組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第1版)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010:49-51．

收稿日期：(2013-11-19)

文章編號(hào)：1007-4287(2015)04-0617-03

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