楊永長，肖代雯，陳　亮，劉　華，喻　華，黃文芳

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 檢驗科,四川 成都610072)

臨床分離表皮葡萄球菌附屬基因調節(jié)因子agr基因多態(tài)性分析

楊永長，肖代雯，陳亮，劉華，喻華，黃文芳*

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 檢驗科,四川 成都610072)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0587)

表皮葡萄球菌(S.epidermidis)廣泛分布于人體皮膚和黏膜表面，過去一直認為它是人體的正常菌群。近年來，隨著各種插管，透析技術，醫(yī)用材料等在臨床上的應用日益增多，S.epidermidis成為引起院內感染的重要病原體。在美國，據估計每年用于治療S.epidermidis引起的血流感染的費用大約需要20億美元[1]。S.epidermidis感染已引起醫(yī)學界的廣泛關注。

生物被膜形成是S.epidermidis的主要致病因素，生物被膜的形成受多種基因的調節(jié)，其中附屬基因調節(jié)因子agr在生物被膜形成過程中發(fā)揮重要調控作用[2]。Agr系統(tǒng)包括4種共轉錄分子agrA,agrC,agrD,agrB和效應分子RNAIII，通過調節(jié)生物被膜相關因子抑制生物被膜的形成。研究顯示，agr基因在S.epidermidis中呈多態(tài)性，有三種agr型別[3]。Li等[4]研究表明，agr基因多態(tài)性與S.epidermidis的致病性明顯相關，且臨床分離S.epidermidis中絕大部分屬于agr Ⅰ型。最近Mertens等[5]研究顯示，從血培養(yǎng)和植入材料分離的S.epidermidis以agr Ⅱ型和agr Ⅲ型為主，而在多重耐藥分離株中，以agr Ⅰ型和agr Ⅲ型為主。以上研究結果提示，臨床分離S.epidermidis的agr型別存在差異。本研究通過多重PCR檢測臨床分離S.epidermidis的agr型別，進一步了解我國臨床分離S.epidermidis的agr基因多態(tài)性，探討甲氧西林耐藥和標本來源與agr型別的關系。

1材料與方法

1.1　菌株

84株表皮葡萄球菌來自2012年3月至2013年3月門診及住院患者分離的無重復菌株，所有菌株采用全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，其中血液分離56株，痰液分離16株，中段尿液分離5株，傷口分泌物分離7株。

1.2　儀器和試劑

PCR 反應試劑、100bp DNA Marker 購自北京康為世紀公司，PCR 擴增儀購自美國Bio-Rad 公司，高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，電泳儀購自美國Savant公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司。esp,mecA和agr分型的引物由上海英俊公司合成。

1.3　細菌DNA提取

復蘇低溫保存的表皮葡萄球菌，接種至血平板，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h，收集細菌，10 000 rpm離心5 min，沉淀加40 μl DNA提取液，加熱100℃ 10 min后，10 000 rpm離心5 min，上清液即為表皮葡萄球菌DNA。

1.4　PCR擴增esp基因

esp基因的引物序列為esp F:5'-CCAGGGTAACCAGTAACAGT-3',esp R:5'-GAG CTAAGGGTAATCCAAGA-3',PCR產物長度為244 bp;反應體系：2×Taq PCR Master Mixture 10 μl，10 μM上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反應條件：93℃預變性2 min，93℃變性30 s,42℃退火30 s,72℃延伸30 s，進行30個循環(huán)，最后72℃延伸2 mim，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.5　PCR擴增mecA基因

mecA基因的引物序列為mecAF:5'-GGGATCATAGCGTCATTATTC-3'，mecAR:5'-AACGATTG TGA CACGATAGCC-3'，PCR產物長度為527 bp。反應體系：2×Taq PCR Master Mixture 10 μl，10 μM上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，44℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行30個循環(huán)；最后72℃延伸3 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后Bio-Rad凝膠成像儀檢測。

1.6　多重PCR擴增agr等位基因

參考文獻根據[6]合成引物，agr分型的引物序列及PCR產物長度見表1，反應體系：2×Taq PCR Master Mixture 10 μl，10 μM上下游引物各0.1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 7.4 μl。反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，進行25個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后Bio-Rad凝膠成像儀檢測。

表1　表皮葡萄球菌agr分型引物序列及PCR產物長度

2結果

2.1　PCR擴增esp基因鑒定表皮葡萄球菌

PCR擴增結果顯示，臨床分離的84株表皮葡萄球菌均可擴增出244 bp的esp基因片段，證實這些菌株都是表皮葡萄球菌。

2.2　PCR擴增mecA基因區(qū)分MSSE和MRSE

臨床分離的84株表皮葡萄球菌中，mecA擴增陽性64株，mecA陰性20株，其中血液，痰液，尿液和傷口分泌物分離mecA陽性菌株分別為43例，11例，5例和5例，提示不同來源分離的表皮葡萄球菌均以MRSE為主。

2.3　多重PCR擴增agr等位基因分析表皮葡萄球菌agr基因多態(tài)性

多重PCR凝膠電泳結果如圖1所示，臨床分離的84株表皮葡萄球菌中，可進行agr分型的表皮葡萄球菌為64株，agr未分型為20株。在MSSE和MRSE中agr基因亞型的分布如表2所示,不同來源分離的表皮葡萄球菌的agr基因亞型分布如表3所示，結果表明，MRSE中以agr Ⅰ型和agrⅢ型為主，血液來源表皮葡萄球菌以agr Ⅰ型，agr未分型和agr Ⅲ型較普遍，非血液來源表皮葡萄球菌以agr Ⅰ型為主。

Lane 1,2:agr Ⅰ型表皮葡萄球菌;Lane 3:100 bp DNA Ladder;Lane 4:agr Ⅰ型表皮葡萄球菌;Lane 5:agr Ⅱ型表皮葡萄球菌;Lane 6:agr Ⅲ型表皮葡萄球菌

圖1　多重PCR擴增表皮葡萄球菌agr等位基因電泳圖

表3　不同來源分離表皮葡萄球菌agr基因亞型分布

3討論

近年來，隨著留置靜脈導管等侵襲性操作的增多，表皮葡萄球菌已成為最重要的院內感染病原菌。表皮葡萄球菌的致病性主要與形成生物被膜的能力密切相關。生物被膜可逃逸機體免疫系統(tǒng)的攻擊，降低其對抗生素的敏感性，引起慢性反復感染，延長住院時間，增加治療費用[7-8]。隨著多重耐藥菌株的出現，這種情況變得越來越嚴重。因此，深入了解生物被膜的調控變得特別重要。

葡萄球菌agr是一種重要的生物被膜調控系統(tǒng)。研究顯示，表皮葡萄球菌agr基因具有多態(tài)性，Dufour等[3]通過序列分析發(fā)現表皮葡萄球菌有三種agr型別，2004年Li等[4]通過PCR-RFLP和DNA測序技術研究發(fā)現，在臨床分離的表皮葡萄球菌中，以agrⅠ型為主，而在正常皮膚表面分離的表皮葡萄球菌以agrⅡ型為主，同時存在大約15%的表皮葡萄球菌agr自然突變。Hellmark等[9]發(fā)現人工關節(jié)感染表皮葡萄球菌中，以agrⅠ型和agrⅢ型為主。Mertens等[5]研究顯示血培養(yǎng)和植入材料分離的表皮葡萄球菌以agrⅡ型和agrⅢ型為主，但在多重耐藥菌株中以agrⅠ型和agrⅢ型為主。

本研究中，我們通過PCR擴增mecA基因區(qū)分甲氧西林敏感和耐藥表皮葡萄球菌，同時通過多重PCR擴增表皮葡萄球菌agr等位基因，分析agr基因多態(tài)性。結果顯示，MSSE菌株約占1/4，11株agr未分型。MRSE菌株約占3/4，以agrⅠ型和agrⅢ型為主，同時伴有部分agr未分型菌株。從標本來源看，血液來源的標本以agrⅠ型，agr未分型和agrⅢ型為主，對于非血液來源的標本以agrⅠ型為主，與文獻報道有相似之處，但本研究中agr未分型菌株較多，可能原因是agr自然突變導致，也可能是多重PCR不能擴增這些agr型別。由于agr多態(tài)性都集中在agrC的后半部分，整個agrD以及agrB的前半部分，接下來，我們將通過PCR擴增具有多態(tài)性的agr全長約1 000 bp的DNA片段，擴增陽性進行測序判斷agr型別，陰性則認為是agr自然突變株。

本研究通過多重PCR對臨床分離表皮葡萄球菌進行agr分型，并從耐藥和標本來源兩方面分析了表皮葡萄球菌agr基因多態(tài)性的差異，為了解臨床分離表皮葡萄球菌的分子特征奠定了基礎。

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[3]Dufour P,Jarraud S,Vandenesch F,et al.High genetic variability of the agr locus in Staphylococcus species[J].J Bacteriol,2002,184(4):1180.

[4]Li M,Guan M,Jiang XF,et al.Genetic polymorphism of the accessory gene regulator (agr) locus in Staphylococcus epidermidis and its association with pathogenicity[J].J Med Microbiol,2004,53:545.

[5]Mertens A,Ghebremedhin B.Genetic determinants and biofilm formation of clinical Staphylococcus epidermidis isolates from blood cultures and indwelling devises[J].Eur J Microbiol Immunol,2013,3(2):111.

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摘要：目的探討臨床分離表皮葡萄球菌附屬基因調節(jié)因子agr基因多態(tài)性，了解表皮葡萄球菌的分子特征。方法收集84株臨床分離并經過全自動微生物鑒定系統(tǒng)準確鑒定的表皮葡萄球菌，通過PCR擴增esp和mecA基因準確鑒定和區(qū)分甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)，采用多重PCR擴增表皮葡萄球菌 的agr等位基因，分析agr基因多態(tài)性。結果84株臨床分離表皮葡萄球菌中，20株為MSSE，占23.80%，其中agr Ⅰ型5株，agr Ⅱ型2株，agr Ⅲ型2株，agr未分型11株。64株為MRSE，占76.20%，其中agr Ⅰ型37株，agr Ⅱ型7株，agr Ⅲ型11株，agr未分型9株。血液來源的表皮葡萄球菌中，agr Ⅰ型25株，agr Ⅱ型5株，agr Ⅲ型10株，agr未分型16株。非血液來源的表皮葡萄球菌中，agr Ⅰ型17株，agr Ⅱ型4株，agr Ⅲ型3株，agr未分型4株。結論臨床分離表皮葡萄球菌agr基因存在明顯多態(tài)性，MSSE中未分型agr較常見，MRSE中以agr Ⅰ型和agrⅢ型為主。

關鍵詞：表皮葡萄球菌；附屬基因調節(jié)因子；基因多態(tài)性；耐甲氧西林表皮葡萄球菌

Gene polymorphism of the accessory gene regulator (agr) inStaphylococcusepidermidisisolated from clinical samplesYANGYong-chang,XIAODai-wen,CHENLiang,etal.(ClinicalLaboratoryDepartment,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital,Chengdu610072,China)

Abstract:ObjectiveTo study gene polymorphism of the accessory gene regulator (agr) in clinically isolated Staphylococcus epidermidis(S.epidermidis),and to find the molecular characteristic of S.epidermidis.Methods84 strains of S.epidermidis identified accurately by full automation microbiological identification system were collected,and PCR was used to amplify esp and mecA gene to differentiate methicillin-resistant S.epidermidis (MRSE) and methicillin-sensitive S.epidermidis (MSSE).Agr typing of clinically isolated S.epidermidis was performed by multiplex PCR.ResultsAmong the strains,20 strains were MSSE,which occupied for 23.80%,and 5 strains belonged to agr type Ⅰ,2 strains belonged to agr type Ⅱ,2 strains belonged to agr type Ⅲ,and 11 strains belonged to non-typable agr type.While 64 strains were MRSE,occupied for 76.20%,and 37 strains belonged to agr type Ⅰ,7 strains belonged to agr type Ⅱ,11 strains belonged to agr type Ⅲ,and 9 strains belonged to non-typable agr type.Among strains isolated from blood culture,25 strains belonged to agr type Ⅰ,5 strains belonged to agr type Ⅱ,10 strains belonged to agr type Ⅲ,and 16 strains belonged to non-typable agr type.As for strains isolated from non-blood samples,17 strains belonged to agr type Ⅰ,4 strains belonged to agr type Ⅱ,3 strains belonged to agr type Ⅲ,and 4 strains belonged to non-typable agr type.Conclusionagr polymorphisms of the accessory gene regulator (agr) are found in clinically isolated S.epidermidis,and agr type Ⅰ and Ⅲ are prevalent among MRSE,while non-typable agr type is common in MSSE strains.

Key words:S.epidermidis;accessory gene regulator;gene polymorphism;methicillin-resistant S.epidermidis

收稿日期：(2014-06-07)

作者簡介：楊永長(1977-)，男，四川南充人，碩士，四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院主管技師，主要從事臨床微生物研究；黃文芳(1957-)，男，四川資中人，博士，碩士導師，四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院研究員，主要從事臨床檢驗研究。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R378.1+1

文章編號：1007-4287(2015)04-0587-04

通訊作者*