王曉鑫，王朝陽(yáng)，周　靜

(1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

shRNA干擾MDR1基因逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞多藥耐藥性的研究

王曉鑫1，王朝陽(yáng)1，周靜2*

(1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0543)

腫瘤多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)是引起腫瘤化療失敗的重要原因之一。由MDRl基因編碼的P-糖蛋白(P-glycopmtein,P-gp) 作為一種ATP依賴性藥物泵,影響藥物在細(xì)胞內(nèi)聚集,是導(dǎo)致MDR最直接原因。P-gp在胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，且與細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[1]。因此MDR1/P-gp可作為逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA) 技術(shù)沉默MDR1基因，轉(zhuǎn)染胃癌耐奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)細(xì)胞SGC7901/L-OHP，觀察轉(zhuǎn)染前后胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥L-OHP和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)敏感性的變化，為臨床胃癌化療耐藥性的逆轉(zhuǎn)、提高療效，尋找新的靶點(diǎn)和途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要材料SGC7901細(xì)胞購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)；質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo、大腸桿菌DH5α、特異針對(duì)MDR1基因及非特異性陰性對(duì)照序列購(gòu)自上海吉瑪公司；Lipofectimane2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；P-gp一抗和羊抗兔二抗購(gòu)于Santa公司， RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GreenI熒光定量試劑盒購(gòu)于 Gene Copoeia公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、H-DMEM和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；L-OHP、5-FU 購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)用含10 %胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC7901細(xì)胞，在37℃、5 %CO2條件下孵育，2～3 d 換液一次，常規(guī)消化傳代。

1.3構(gòu)建SGC7901/L-OHP耐藥細(xì)胞系篩選IC90濃度L-OHP下存活的SGC7901細(xì)胞克隆，采用劑量遞增法誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥細(xì)胞[2]。在細(xì)胞傳代換液時(shí)加入不同濃度的L-OHP，首次加藥劑量為1.6 μg·mL-1(1/9IC50)，每周傳代2 次。待細(xì)胞生長(zhǎng)良好進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增加0.5倍L-OHP藥物濃度，最高濃度為18.2 μg·mL-1。給藥4月后獲得對(duì)L-OHP耐藥的SGC7901細(xì)胞，命名為SGC7901/L-OHP細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前1w停用L-OHP處理。

1.4MTT法檢測(cè)L-OHP、5-FU對(duì)SGC7901/L-OHP的細(xì)胞毒作用 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901和SGC7901/L-OHP細(xì)胞， 制成細(xì)胞懸液，按1×104個(gè)·孔-1細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的L-OHP (64、32、16、8、4、2μg·mL-1)，5-FU(160、80、40、20、10 和5 μg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT 20 μL，混勻，再培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，充分震蕩后酶標(biāo)儀上測(cè)570 nm 波長(zhǎng)處吸光度值。每一濃度設(shè)5 個(gè)平行孔，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)。以背景組調(diào)零，按以下公式計(jì)算各組細(xì)胞的存活率：細(xì)胞存活率=(OD570實(shí)驗(yàn)組-OD570背景組)/(OD570空白組-OD570背景組)×100% ；并計(jì)算各組IC50值和耐藥倍數(shù)(resistance fold，RF)：RF =IC50(耐藥細(xì)胞)/ IC50(親本細(xì)胞)。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前16 h，將SGC7901/L-OHP耐藥細(xì)胞以1×106·孔-1的密度接種于6 孔培養(yǎng)板，按照Lipofectamine TM2000 試劑盒說(shuō)明書操作，將脂質(zhì)體和質(zhì)粒孵育形成脂質(zhì)復(fù)合體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板中，6 h 后更換含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組、陰性質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組(pGPU6/GFP/Neo- MDR1組)。

1.6real-time PCR 檢測(cè)MDR1 mRNA 的表達(dá)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901/L-OHP細(xì)胞36 h后，用Trizol 試劑提取總RNA。測(cè)定各組細(xì)胞的總RNA濃度，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照試劑盒的方法，進(jìn)行real-time PCR 反應(yīng)。β-actin 為內(nèi)參，上游引物:5′-GCACCTGTAGCGCAAAGAGC-3′，下游引物:5′-GTTCATTCCCTGTAACGCCT-3′， 62 ℃退火。MDR-1 基因上游引物:5′-GATTATTCTTAAAGATCAAT-3′，下游引物:5′-TTAGAAACTTAATATTATTC-3′，58 ℃ 退火。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7Western blot 檢測(cè)P-gp的表達(dá)免疫共沉淀裂解液提取總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。每孔加入50 pg蛋白質(zhì)，將電泳分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉過(guò)夜，加入P-gp一抗孵育2 h，PBST洗滌3 次，羊抗兔二抗孵育2 h，洗滌3 次。用Labwork4圖像分析軟件進(jìn)行光密度積分值分析。

1.8體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組、陰性質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組(pGPU6/GFP/Neo MDR1組)。將SGC7901/L-OHP細(xì)胞接種于96 孔板( 每孔1×104個(gè)細(xì)胞) ，按1.4 MTT法檢測(cè)L-OHP、5-FU對(duì)pGPU6/GFP/Neo- MDR1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SGC7901/L-OHP細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并計(jì)算IC50值。每一濃度設(shè)5 個(gè)平行孔，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1SGC7901/L-OHP耐藥細(xì)胞系的建立采用藥物濃度遞增法獲得了能耐受18.2μg·ml-1L-OHP生長(zhǎng)良好的SGC7901/L-OHP耐藥細(xì)胞。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：L-OHP作用SGC7901細(xì)胞的IC50值(12.26μg·ml-1)明顯低于作用SGC7901/L-OHP細(xì)胞的IC50值(74.33μg·ml-1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，RF為6.06。本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)獲得的SGC7901/L-OHP細(xì)胞不僅對(duì)L-OHP耐藥， 而且對(duì)5-FU也產(chǎn)生交叉耐藥特性，RF為1.82(表1)。

2.2pGPU6/GFP/Neo- MDR1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901/L-OHP細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，空白對(duì)照組無(wú)熒光表達(dá)，陰性質(zhì)粒組和pGPU6/GFP/Neo-MDR1重組質(zhì)粒組均可見綠色熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染率達(dá)90%以上(圖1)。

表1　　SGC7901和SGC7901/L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP和5-FU

*P<0.05，**P<0.01，vs SGC7901 group

2.3real- time PCR法檢測(cè)MDR-1基因表達(dá)以β-actin為內(nèi)參，與空白對(duì)照組和陰性質(zhì)粒組比較，重組質(zhì)粒組細(xì)胞內(nèi)MDR1 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)[(23.019±0.084)%]，與空白對(duì)照組[(89.649±0.052)%]和陰性質(zhì)粒組[(85.701±0.075)%]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明pG-PU6/GFP/Neo- MDR1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901/L-OHP細(xì)胞后MDR1基因被穩(wěn)定抑制，成功沉默SGC7901/L-OHP細(xì)胞株的MDR1基因。

A:negative plasmid group; B:recombinant plasmid group(×100)

2.4Western blot檢測(cè)P-gp蛋白的表達(dá)重組質(zhì)粒組P-gp蛋白表達(dá)受抑制(0.366±0.025)，明顯低于空白對(duì)照組(0.679±0.027)和陰性質(zhì)粒組(0.692±0.024)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

A:control group; B:recombinant plasmid group;C:negative

plasmid group

圖2P-gp蛋白表達(dá)

2.5沉默MDR1后的SGC7901/L-OHP藥物敏感性實(shí)驗(yàn)pGPU6/GFP/Neo- MDR1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901/L-OHP細(xì)胞后，用MTT法檢測(cè)L-OHP、5-FU對(duì)SGC7901/L-OHP的IC50。結(jié)果顯示，沉默MDR1基因后，耐藥細(xì)胞SGC7901/L-OHP與陰性質(zhì)粒組和空白對(duì)照組相比不僅對(duì)L-OHP的IC50明顯下降，而且對(duì)5-FU的IC50也降低，差異有顯著性(P<0.05)。說(shuō)明沉默MDR1可以改善胃癌細(xì)胞的多藥耐藥性，增加細(xì)胞對(duì)L-OHP和5-FU的敏感性(表2)。

表2　shRNA干擾MDR1基因表達(dá)后 SGC7901/L-OHP

*P<0.05，vs control group

3討論

目前，化療是胃癌的最主要治療措施，但腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象尤其是多藥耐藥，往往導(dǎo)致化療失敗。腫瘤多藥耐藥是指對(duì)某一種藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，腫瘤細(xì)胞對(duì)結(jié)構(gòu)不同、細(xì)胞作用靶點(diǎn)不同的多種化療藥物產(chǎn)生交叉性耐藥[3]。MDR的產(chǎn)生嚴(yán)重影響了腫瘤的化療效果[4]。MDR1 基因編碼P-gp蛋白的過(guò)表達(dá)，在臨床化療耐藥中發(fā)揮顯著作用，尤其是實(shí)體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤，包括消化道腫瘤：結(jié)腸癌、胃癌等。P-gp 蛋白是一種ATP 依賴性藥物跨膜外流泵，與化療藥結(jié)合后能依賴ATP 供能將疏水性藥物泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物有效濃度下降，造成耐藥現(xiàn)象[5,6]。因此逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥策略成為克服腫瘤多藥耐藥的最直接的方法[7,8]。目前已開發(fā)了以P-gp為靶點(diǎn)的三代抑制劑(維拉帕米，環(huán)孢素A類似物，多非喹達(dá)，米托坦等)抑制P-gp的表達(dá)或者功能，但是它的II /III 期臨床試驗(yàn)并沒(méi)有取得滿意的效果，限制了其廣泛的應(yīng)用[9]。RNA干擾技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的基因沉默技術(shù)，用與靶基因序列同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)，沉默細(xì)胞內(nèi)同源mRNA的表達(dá)，而不影響其他基因的mRNA表達(dá)，達(dá)到特異性剔除或關(guān)閉特定基因表達(dá)的效果，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄后的基因沉默[10]。RNA干擾技術(shù)已被廣泛用于探討基因功能和惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。其中shRNA技術(shù)與傳統(tǒng)RNA干擾技術(shù)相比具有特異性強(qiáng)、容易轉(zhuǎn)染、表達(dá)豐度高的特點(diǎn)[11]。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)shRNA技術(shù)干擾胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/L-OHP中MDR1基因的表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染后耐藥細(xì)胞株對(duì)L-OHP和5-FU耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。

L-OHP是鉑類化療藥的一種，通過(guò)與DNA鏈的堿基形成交叉聯(lián)結(jié)而破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能。L-OHP是臨床治療胃癌的一線化療藥和術(shù)后輔助化療藥。但L-OHP在臨床廣泛應(yīng)用的同時(shí)，也產(chǎn)生了腫瘤耐藥的嚴(yán)重問(wèn)題，導(dǎo)致化療的失敗。本研究以L-OHP為誘導(dǎo)劑，采用逐漸增加L-OHP濃度誘導(dǎo)建立人胃癌細(xì)胞SGC7901/L-OHPL-OHP耐藥模型。MTT結(jié)果顯示L-OHP 對(duì)SGC7901/L-OHP細(xì)胞作用的IC50值比SGC7901細(xì)胞明顯升高，RF為6.06，而且對(duì)5-FU也表現(xiàn)一定的耐藥性。5-FU常與L-OHP聯(lián)合組成DF方案用于胃癌的常規(guī)化療。按照RF<5認(rèn)為是低度耐藥，RF為5～15中度耐藥，RF>15高度耐藥[12]。SGC7901/ L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP屬于中度耐藥，對(duì)5-FU具有低度耐藥，證實(shí)SGC7901/ L-OHP具有多藥耐藥細(xì)胞系的特征。

pGPU6/GFP/Neo- MDR1重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC7901/ L-OHP后，經(jīng)real-time PCR 和Western blot 檢測(cè)，SGC7901/L-OHP細(xì)胞中MDR1 基因的表達(dá)顯著降低(P<0.01) ，MDR1基因的表達(dá)產(chǎn)物P-gp的表達(dá)下降(P<0.05)。說(shuō)明shRNA技術(shù)能高效、特異性地阻斷特定基因的表達(dá)，使目標(biāo)基因MDR1的同源mRNA降解，減少特異蛋白P-gp的表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)功能的抑制。細(xì)胞藥敏試驗(yàn)表明干擾MDR1基因可有效逆轉(zhuǎn)SGC7901/ L-OHP細(xì)胞耐藥性，使胃癌細(xì)胞對(duì)L-OHP和5-FU敏感性提高。以上結(jié)果均提示shRNA技術(shù)沉默MDR1基因可有效逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的多藥耐藥，MDR1基因是逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的有效靶點(diǎn)。

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摘要：目的利用短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA,shRNA) 技術(shù)沉默多藥耐藥基因1(multidrug resistance,MDR1)，探討其對(duì)SGC7901/ L-OHP細(xì)胞株多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。方法采用逐步增加藥物濃度法建立耐奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)的胃癌細(xì)胞株SGC7901/L-OHP，用shRNA技術(shù)沉默MDR1基因在SGC7901/ L-OHP細(xì)胞中的表達(dá)，以real-time PCR 檢測(cè)細(xì)胞中MDR1 mRNA 的表達(dá)，Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中P糖蛋白(P-glycopmtein,P-gp)的表達(dá)，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SGC7901/L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP和5-FU的敏感性。結(jié)果shRNA沉默SGC7901/ L-OHP細(xì)胞株MDR1基因后，與空白組和陰性質(zhì)粒組比較，MDR1 mRNA表達(dá)抑制(P<0.01)，且P-gp表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。干擾后的SGC7901/L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP和5-FU的敏感性顯著升高(P<0.05)。結(jié)論shRNA可有效沉默SGC7901/ L-OHP胃癌耐藥細(xì)胞株MDR1基因的表達(dá)，提高耐藥的胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性。

關(guān)鍵詞：胃癌；多藥耐藥；shRNA

Reversion of multidrug resistance in gastric cancer cell by shRNA targeting MDR1 geneWANGXiao-xin1,WANGZhao-yang1,ZHOUJing2.(1.AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity，Hohhot010050，China;2.InnerMongoliaMedicalUniversity，Hohhot010110，China)

Abstract:ObjectiveTo silence the expression of multidrug resistance (MDR1) gene in SGC7901/ L-OHP cell line by using short hairpin RNA (shRNA) in order to reverse its resistance to MDR1.MethodsA human drug-resistance gastric cancer cell line,SGC7901/L-OHP,was generated by continuous exposure to gradually increasing concentrations of L-OHP. MDR1 gene expression in SGC7901/ L-OHP cells was inhibited by using shRNA. The expression of MDR1 mRNA in SGC7901/ L-OHP cells was assayed by real-time PCR. The P-gp protein expression was determined by Western blot analysis. The sensitivity to L-OHP and 5-FU was measured by MTT assay in SGC7901/ L-OHP cells after shRNA. ResultsCompared with the control group and negative plasmid group,the expression of MDR1 mRNA and P- gp were reduced obviously after silencing the expression of MDR1 gene in SGC7901/ L-OHP cell line by using shRNA (P<0.01,P<0.05). The sensitivity of SGC7901/L-OHP cells to L-OHP and 5-FU increased significantly after the interference (P<0.05). Conclusion shRNA can effectively inhibit the expression of MDR1 gene in SGC7901/L-OHP cell line and improve the sensitivity of gastric cancer cells to chemotherapy drugs.

Key words:Gastric cancer; Multidrug resistance; short hairpin RNA

收稿日期：(2014-02-21)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R735.2

通訊作者*

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金(BSJJ2013,BSJJ2012)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(NJZY14132)