崔　倪，王建霞，張海英，李祎南，李明月，邢樹剛，李　偉*,李一雷*

(1.吉林大學基礎醫(yī)學院病理學系，病理生物學教育部重點實驗室，吉林 長春130021；

2.吉林大學白求恩醫(yī)學部臨床醫(yī)學院2011級5年制，吉林 長春130021)

CTLA-4抗體抑制小鼠Lewis肺癌生長的實驗研究

崔倪1,2，王建霞1，張海英1，李祎南1，李明月1，邢樹剛1，李偉1*,李一雷1*

(1.吉林大學基礎醫(yī)學院病理學系，病理生物學教育部重點實驗室，吉林 長春130021；

2.吉林大學白求恩醫(yī)學部臨床醫(yī)學院2011級5年制，吉林 長春130021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0532)

近年來，細胞毒性T細胞抗原(cytotoxic T lymphocyte antigen-4， CTLA-4)已經(jīng)成為腫瘤免疫治療的關鍵生物靶點，對惡性黑色素瘤的治療具有顯著療效，但對其它腫瘤的療效尚不確定[1,2]，并且CTLA-4抗體處理后對體內(nèi)腫瘤血管新生情況的影響尚未見報道。本項目擬制備小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型，研究CTLA-4單克隆抗體對小鼠肺癌生長的影響，觀察腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫狀態(tài)及血管新生情況。

1材料與方法

1.1實驗動物及腫瘤細胞系C57BL/6雄性小鼠，6-8周齡，體重18-22 g，購自吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心。小鼠Lewis肺癌細胞系來自吉林大學病理生物學教育部重點實驗室。細胞置于5% CO2，37℃孵箱中，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2藥物及主要試劑小鼠抗CTLA-4單克隆抗體9H10(Bioxcel公司，美國)，胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen， 美國)，兔抗鼠CD4抗體、兔抗鼠CD8抗體、兔抗鼠CD34抗體、SP免疫組化試劑盒及DAB發(fā)色劑(福州邁新生物技術有限公司)。

1.3小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的制備小鼠Lewis肺癌細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代2-3次后，取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min離心5 min，棄上清,加0.9%的生理鹽水懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度至1.0×106/ml，接種于小鼠右側后背部皮下，每只注射0.1 ml。

1.4實驗動物分組及給藥將建立移植瘤的小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組6只。實驗組在接種腫瘤當天(D0)開始注射CTLA-4抗體9H10，抗體腹膜內(nèi)注射，劑量100 μg/只，每3天注射2個50 μg，至第21天。對照組注射相同劑量的生理鹽水。

1.5移植瘤平均體積、重量及腫瘤抑制率檢測治療開始日為第1天，每3天測量腫瘤的最大直徑(a)和最大橫徑(b)并計算體積，繪制腫瘤生長曲線。共治療21天，治療結束后第2天首先采用摘眼球取血法取小鼠外周血，再采用頸椎脫臼法處死所有小鼠，取出脾，腫瘤測量體積，計算腫瘤生長抑制率。腫瘤體積(V)=a×b2/2；腫瘤生長抑制率=(對照組瘤重-實驗組瘤重)/對照組瘤重×100%。

1.6標本處理與免疫組織化學染色腫瘤組織及脾置10%中性福爾馬林緩沖液固定，經(jīng)脫水、浸蠟及包埋后，切3 μm厚切片。用檸檬酸抗原修復液進行抗原熱修復，加封閉液后，滴加一抗4℃過夜，次日加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，ABC法顯色，顯微鏡下觀察到棕黃色即放入自來水中終止顯色。蘇木精復染細胞核1-3分鐘，固定后光鏡下觀察并拍照。

1.7結果判定標準Olympus顯微鏡成像系統(tǒng)，DP73照相機采圖，鏡下避開中間因血液供應不足而造成的壞死明顯部位及其邊緣，在腫瘤周圍生長旺盛的部位采圖，每張切片采集5個視野，雙盲法進行計數(shù)。CD4及CD8陽性顆粒主要定位于淋巴細胞膜，以淋巴細胞膜中出現(xiàn)棕黃色為陽性標準，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計算每個視野中陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。CD34陽性內(nèi)皮細胞被染成棕黃色。在低倍鏡下尋找血管密集的部位采圖，每張切片采集5個視野，雙盲法進行計數(shù)，單個陽性細胞、獨立陽性小細胞團或者一個小管腔計為一個血管。MVD = CD34陽性管腔數(shù)均值。

2結果

2.1C57 荷Lewis肺癌小鼠生長曲線分析移植瘤接種3天后，荷瘤小鼠開始出現(xiàn)腫瘤，空白對照組小鼠的腫瘤體積隨時間逐漸增大，局部呈結節(jié)狀。按照JP.Allison文獻里報道的標準，腫瘤體積≥1cm3記為死亡。實驗結果顯示：與空白對照組相比較，應用anti-CTLA-4組可以延緩荷瘤小鼠的腫瘤生長速度，延長其生存時間(圖1)。

將1×106個細胞注入小鼠后背部皮下，接種第3天開始用藥，直到用藥到21天，用藥期間測量腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線。

圖1荷瘤小鼠生長曲線

2.2CTLA-4抗體對Lewis肺癌荷瘤小鼠脾組織中CD4及CD8陽性T細胞表達的影響為了明確CTLA-4抗體對Lewis肺癌荷瘤小鼠細胞免疫能力的影響，于用藥21天后，處死小鼠取脾組織，用免疫組織化學染色檢測荷瘤小鼠脾臟中CD4及CD8陽性T細胞的表達。結果顯示，實驗組與對照組CD4陽性T細胞的數(shù)量分別為(49.05±7.31)%和(23.45±8.06)%，與對照組比較，應用CTLA-4抗體處理后CD4表達陽性率顯著增高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2-1，2-2)。實驗組和對照組中CD8表達的陽性率分別為17.25±2.86和11.32±0.71，與對照組比較，應用CTLA-4抗體處理后CD8表達的陽性率明顯增高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3-1,3-2)。

CD4主要表達在T淋巴細胞的胞膜。A：對照組；B：CTLA-4抗體組。

圖2-1免疫組織化學染色檢測荷瘤小鼠脾組織中CD4的表達(SP法.x400)圖2-2CTLA-4抗體對荷瘤小鼠脾組織

內(nèi)CD4表達陽性率的影響

2.3CTLA-4抗體對荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中微血管密度的影響為了檢測CTLA-4抗體對腫瘤微環(huán)境中血管新生情況的影響，我們用抗CD34單克隆抗體標記腫瘤微血管內(nèi)皮細胞，計數(shù)腫瘤間質(zhì)微血管密度(MVD)值。結果顯示，空白對照組MVD為75.72±14.49，CTLA-4抗體組MVD為37.20±2.84，與空白對照組比較，CTLA-4抗體處理后，腫瘤MVD值明顯降低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。(圖4-1，4-2 )。

CD8主要表達在T淋巴細胞的胞膜。A：對照組；B：CTLA-4抗體組。

圖3-1免疫組織化學染色檢測荷瘤小鼠脾組織中CD8的表達(SP法.x400)圖3-2CTLA-4抗體對荷瘤小鼠脾組織

內(nèi)CD8表達陽性率的影響

A：對照組；B：CTLA-4抗體組

圖4-1荷瘤小鼠脾組織中CD34的表達。(SP法.x200)圖4-2CTLA-4抗體對荷瘤小鼠腫瘤組織

內(nèi)微血管密度的影響

3討論

細胞毒性T細胞抗原(CytotoxicTlymphocyteantigen，CTLA-4)是白細胞表面的跨膜蛋白CD152，在機體的免疫調(diào)控中，這些分子競爭性地與T細胞表面的CD28結合，阻礙T細胞活化，對免疫起負調(diào)控作用[3,4]。在腫瘤發(fā)生時，腫瘤間質(zhì)中大量聚集的免疫細胞表面的CTLA-4及其相應的受體表達上調(diào)，使免疫細胞處于失活狀態(tài)，腫瘤細胞逃逸免疫監(jiān)視[5,6]。近年來CTLA-4已經(jīng)成為腫瘤免疫治療的關鍵生物靶點，抗CTLA-4抗體目前已被美國食物與藥品監(jiān)督管理局批準為治療惡性黑色素瘤的臨床用藥，但對其它腫瘤的療效尚不確定，并且CTLA-4抗體治療后對體內(nèi)腫瘤血管新生情況的影響尚未見報道[1，2，7,8]。

本實驗制備小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型，進而應用CTLA-4單克隆抗體檢測對小鼠肺癌生長的影響，觀察腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫狀態(tài)及血管新生情況，為進一步揭示腫瘤血管新生與免疫抑制之間的調(diào)控網(wǎng)絡提供實驗依據(jù)。研究結果顯示，應用CTLA-4抗體可延緩荷瘤小鼠的腫瘤生長速度，延長其生存時間。CTLA-4抗體處理21天后，取荷瘤小鼠脾臟，監(jiān)測免疫學指標的變化。實驗結果顯示，與對照組比較，應用CTLA-4抗體處理后，荷瘤小鼠脾組織中CD4及CD8陽性T細胞均明顯增多。其可能機制為：抗CTLA-4抗體阻斷了腫瘤浸潤T淋巴細胞表面的CTLA-4-B7信號傳導通路，有效地阻斷了抑制性信號的活化，同時提高腫瘤浸潤性CD4及CD8陽性T細胞的數(shù)量及相關細胞因子的分泌[9]。CD8陽性T細胞為細胞毒性T細胞，在細胞介導的抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[10,11]。CD4T細胞分為輔助性T細胞(Thcells)和調(diào)節(jié)性T細胞(Tregcells)，其中Th1細胞介導細胞免疫，可以協(xié)同激活細胞毒性T細胞，Th2則介導體液免疫，主要激活B細胞，Treg細胞為抑制性T細胞[12,13]。本研究中CTLA-4抗體處理后CD4陽性T細胞百分比增高，其中輔助性T細胞及調(diào)節(jié)性T細胞所占比例以及它們在抗腫瘤免疫中的作用有待于進一步通過流式細胞學檢測證實。

腫瘤生長到幾個立方毫米時處于缺氧狀態(tài)，腫瘤細胞通過分泌缺氧誘導因子(hypoxiainduciblefactor-1,HIF-1)及VEGF等細胞因子促進CD4陽性T細胞向Treg細胞分化，Treg細胞可釋放VEGF等，誘導血管生成，還可通過分泌細胞因子，如IL-6、IL-17等，激活stat3轉錄因子，間接誘導腫瘤血管新生[14,15]。腫瘤間質(zhì)內(nèi)的新生血管可以為腫瘤生長提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，促使腫瘤細胞的增殖和轉移，并且有助于免疫抑制細胞向腫瘤微環(huán)境聚集[16]。因此，腫瘤誘導的免疫抑制和促進血管新生之間形成了一個相互誘導的有利于腫瘤生長的調(diào)控網(wǎng)絡。本研究中，我們采用免疫組化染色標記荷瘤組織微環(huán)境中微血管內(nèi)皮細胞，計算腫瘤微血管密度(MVD)值，結果顯示經(jīng)CTLA-4抗體治療后，荷瘤小鼠Lewis肺癌間質(zhì)中的MVD顯著降低。由此可見，在腫瘤微環(huán)境中，免疫細胞處于失活抑制狀態(tài)，免疫抑制細胞釋放的炎癥因子誘導腫瘤血管生成，新生的血管又為腫瘤細胞的生長和轉移提供必要的條件[6]?？笴TLA-4抗體不但能夠激發(fā)腫瘤特異性T細胞繼續(xù)增殖，激活免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用，提高機體對抗腫瘤的主動免疫作用，同時也能有效地阻斷腫瘤間質(zhì)的微血管生成[7]。

綜上所述，本研究結果表明應用抗CTLA-4單克隆抗體可有效地提高荷瘤小鼠Lewis肺癌微環(huán)境中CD4及CD8陽性T細胞的數(shù)量，同時抑制腫瘤間質(zhì)的血管生成。為以CTLA-4為靶點進行肺癌的治療研究提供了實驗證據(jù)。

注：該項目參加了2012年度 吉林大學“挑戰(zhàn)杯”大學生課外學術科技作品競賽。

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摘要：目的研究抗CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4)抗體(9H10)對小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用及其機制。方法選取健康適齡C57小鼠，皮下接種小鼠Lewis肺癌細胞系，建立皮下移植瘤模型。12只荷瘤小鼠分為2組，分別為空白對照組和實驗組，分別腹腔注射給予生理鹽水和CTLA-4抗體(9H10)，通過腫瘤體積、重量及腫瘤生長抑制率評估9H10的抑瘤作用；免疫組織化學染色檢測脾組織T細胞亞型(CD4及CD8陽性T細胞)及腫瘤微血管密度(MVD)，通過組間對照分析抗CTLA-4對腫瘤微環(huán)境免疫細胞及血管生成的影響。結果CTLA-4抗體可延緩荷瘤小鼠的腫瘤生長速度，延長其生存時間。免疫組織化學染色檢測荷瘤小鼠脾臟中CD4及CD8陽性T細胞。結果顯示，實驗組與對照組CD4陽性T細胞的數(shù)量分別為(49.05±7.31)%和(23.45±8.06)%，與對照組比較，應用抗CTLA-4處理后CD4表達陽性率明顯增高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。實驗組和對照組中CD8表達的陽性率分別為17.25±2.86和11.32±0.71，與對照組比較，應用抗CTLA-4處理后CD8表達的陽性率明顯增高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。用抗CD34單克隆抗體標記腫瘤微血管內(nèi)皮細胞，計數(shù)腫瘤間質(zhì)MVD。實驗組和對照組的MVD值分別為37.20±2.84和75.72±14.49， CTLA-4使腫瘤MVD明顯減少，具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。結論CTLA-4抗體對荷瘤小鼠Lewis肺癌具有抑制作用，荷瘤小鼠脾組織中CD4 及CD8表達均增高，腫瘤間質(zhì)的MVD值顯著降低。CTLA-4在提供機體抗腫瘤免疫及抑制腫瘤血管生成中均發(fā)揮重要作用。

關鍵詞：Lewis肺癌；細胞毒性T細胞抗原-4(CTLA-4)；CD4；CD8；腫瘤血管

Inhibition of Anti-Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4 Antibody on the Growth of Lewis Lung CancerCUINi,WANGJian-xia,ZHANGHai-ying,etal.(DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,KeyLaboratoryofPathobiology,MinistryofEducation,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the antitumor effects of cytotoxic T lymphocyte antigen-4 antiboby(9H10)on mice Lewis lung cancer.MethodsThe transplantation tumor models were established by injection of Lewis lung cancer cells subcutaneously to C57BL/6 mice.Twelve mice were randomly divided into two groups:The 9H10 therapy group with intraperitoneal injection of cytotoxic T lymphocyte antigen-4 antibody and the control group with the injection of 0.9% sodium chloride respectively.The antitumor effects were investigated by measuring tumor volume,the dynamic change of tumor weight and the inhibition rate of tumor growth.The expression ratio of CD4 and CD8 positive T cells in spleen were detected by immunohistochemistry.Microvessel density (MVD) was assessed by CD31 immunostaining.ResultsThe growth rate of tumor bearing mice were delayed and the survival time were prolonged.The CD4 positive T cells in the spleen of tumor bearing mice were 49.05±7.31% and 23.45±8.06% in 9H10 group and control group respectively.The positive rate of CD4 T cells were significantly increased comparing with control group after CTLA-4 antibody treatment (P<0.01).The CD8 positive T cells were 17.25±2.86 and 11.32±0.71 in 9H10 group and control group respectively.The positive rate of CD8 T cells were significantly increased in the experimental group than in the control group(P<0.05).The tumor interstitial microvessel density (MVD) were 37.20±2.84和75.72±14.49 in the experimental group and control group respectively.The MVD significantly decreased after CTLA-4 antibody treatment (P<0.01).ConclusionThe growth of Lewis lung cancer were inhibited after CTLA-4 antibody treatment.The expression ratio of CD4 and CD8 positive T cells were both increased and the MVD value was lowered in the spleen of Lewis cancer bearing mice after CTLA-4 antibody treatment.CTLA-4 may play significant roles both on increasing the tumor immune and inhibiting tumor angiogenesis.

Key words:Lewis lung cancer;CTLA-4;CD4;CD8 Tumor angiogenesis

收稿日期：(2014-05-09)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R734.2

文章編號：1007-4287(2015)04-0532-05

通訊作者*

基金項目:吉林省科技廳自然科學基金資助課題(20130102084JC)；吉林大學白求恩醫(yī)學科研支持計劃資助課題(2013101005)；吉林大學“大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃”國家級項目資助課題(2013A71249)