尤如芹，王姣琦，劉洪雨，崔　楊，何金婷，紀(jì)秋野，劉永峰，莽　靖*，徐忠信*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)科;b.科學(xué)研究中心，吉林 長春130033；2.美國奧爾巴尼醫(yī)學(xué)院)

Smad4介導(dǎo)Activin A 信號(hào)在PC12細(xì)胞OGD損傷中作用研究

尤如芹1a，王姣琦1a，劉洪雨1a，崔楊1a，何金婷1a，紀(jì)秋野1b，劉永峰2，莽靖1a*，徐忠信1a*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)科;b.科學(xué)研究中心，吉林 長春130033；2.美國奧爾巴尼醫(yī)學(xué)院)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0525)

目前研究認(rèn)為ActA 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在表達(dá)。缺血性腦損傷后，其分泌增加，并以靶源性方式作用于神經(jīng)細(xì)胞，激活A(yù)ctA/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，繼而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能[1,2]?；谄渌到y(tǒng)組織或疾病背景下的研究證實(shí)Smad4可能通過從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)的遷移而介導(dǎo)ActA下游信號(hào)，但在缺血性腦損傷中尚未得到證實(shí)。本研究應(yīng)用神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞的OGD模型體外模擬腦缺血損傷，利用免疫熒光染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡對(duì)Smad4的質(zhì)核分布進(jìn)行檢測(cè)，以明確Smad4在介導(dǎo)PC12細(xì)胞OGD損傷中ActA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的模式及作用。

1材料和方法

1.1　主要材料

大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購自金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。牛血清白蛋白(BSA)、鼠神經(jīng)生長因子(NGF)購自美國Sigma公司。連二亞硫酸鈉購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司。Triton X-100購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗大鼠Smad4一抗購自美國Abcam公司，Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PC12細(xì)胞培養(yǎng)及神經(jīng)元樣轉(zhuǎn)化正常PC12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10 %胎牛血清和10 %馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，并于37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)。細(xì)胞接近70 %融合時(shí)更換為含NGF(終濃度50 ng/ml)的培養(yǎng)液，連續(xù)刺激5天，以誘導(dǎo)細(xì)胞神經(jīng)元樣轉(zhuǎn)化[3]。

1.2.2PC12細(xì)胞氧糖剝奪模型建立取生長狀態(tài)良好的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞，用無糖DMEM培養(yǎng)液輕輕沖洗3次，而后用含10 %胎牛血清和終濃度1.0 mmol/L連二亞硫酸鈉的無糖DMEM培養(yǎng)液于37℃孵箱內(nèi)的缺氧罐中進(jìn)行氧糖剝奪(Oxygen-Glucose Deprivation，OGD)處理[4]。計(jì)時(shí)0 h和3 h建立神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞OGD 0 h和3 h組。

1.2.3Realtime-PCR檢測(cè)ActA mRNA表達(dá)水平Premier 5.0 軟件根據(jù)Genbank檢索的核苷酸序列設(shè)計(jì)ActA引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下：U:5′-TAG TTT ACC TGG GAT GAA GC -3′；D:5′-TAG CAC CCT CTA ACA CCT CT -3′。根據(jù)之前描述的方法于OGD不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用SYBR Green法行Real-time PCR 檢測(cè)[4]。

1.2.4激光共聚焦觀察Smad4的質(zhì)核分布以4×104/密度將PC12細(xì)胞接種于預(yù)先放有細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。次日細(xì)胞貼壁后加入NGF(終濃度50 ng/ml)，連續(xù)誘導(dǎo)5 d。繼而OGD處理0 h、3 h、6 h、12 h后挑出細(xì)胞爬片，0.3% Triton X-100處理20 min，PBS浸洗后，2 % BSA封閉30 min，而后滴加Smad4一抗(1∶500)4℃濕盒中過夜孵育。避光條件下加入Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h后進(jìn)行DAPI(1 μg/ml)染色，37℃避光孵育15 min，梯度脫水后防淬滅封片劑封片，共聚焦顯微鏡554 nm下觀察Smad4的質(zhì)核分布情況。

2結(jié)果

2.1　PC12細(xì)胞的神經(jīng)元樣轉(zhuǎn)化

正常PC12細(xì)胞為圓形或橢圓形，呈半懸浮狀態(tài)，易聚集成團(tuán)。經(jīng)NGF連續(xù)誘導(dǎo)5 d后，細(xì)胞貼壁，停止分裂生長并伸出較長的突觸，呈神經(jīng)元樣。

2.2　ActA mRNA 表達(dá)變化

神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞OGD 3h ActA mRNA相對(duì)表達(dá)量(1.86±0.08)較0 h顯著增高(P<0.05)；OGD 6h表達(dá)量(0.65±0.07)及OGD 12h(0.57±0.06)表達(dá)量逐漸下降(圖1)，與OGD 3h比較，差異顯著(P<0.05)。

注：*與OGD 0h組比較P<0.05，△與OGD 3h組比較P<0.05

2.3　Smad4的質(zhì)核分布比較

激光共聚焦顯微鏡554 nm的激發(fā)光下Cy3標(biāo)記的Smad4呈紅色熒光，細(xì)胞核經(jīng)DAPI復(fù)染后呈藍(lán)色。融合后圖像顯示，OGD 3 h分布于細(xì)胞核內(nèi)Smad4蛋白數(shù)量較OGD0h顯著增多，OGD 6h開始逐漸下降，OGD12 h達(dá)最小值。

3討論

近期研究發(fā)現(xiàn)，作為轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-beta，TGF-β)超家族的成員之一，ActA具有抗缺血性損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的功能[2,8]。ActA作為一種細(xì)胞外的信號(hào)啟動(dòng)因子，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要依靠Smad蛋白家族介導(dǎo)，但目前其參與腦缺血損傷與修復(fù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚未完全闡明。

課題組前期研究證實(shí)，與經(jīng)典的ActA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路一致，在腦缺血損傷誘導(dǎo)的ActA信號(hào)激活過程中，細(xì)胞外的ActA通過與跨膜受體結(jié)合，磷酸化激活下游的Smad2/3[3]。基于其他系統(tǒng)組織或疾病背景下的研究證實(shí)Smad4可能通過從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)的遷移而介導(dǎo)ActA下游信號(hào)[5]，但在缺血性腦損傷中尚未得到證實(shí)。本研究應(yīng)用神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞的OGD模型體外模擬腦缺血損傷，利用免疫熒光染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡對(duì)Smad4的質(zhì)核分布進(jìn)行檢測(cè)，以明確Smad4在介導(dǎo)PC12細(xì)胞OGD損傷中ActA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的模式及作用。結(jié)果顯示：神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞OGD3 h ActA mRNA相對(duì)表達(dá)量較0 h顯著增高；OGD6 h表達(dá)量及OGD12 h表達(dá)量逐漸下降。OGD 3 h分布于細(xì)胞核內(nèi)Smad4蛋白數(shù)量較OGD0h顯著增多，OGD6 h開始逐漸下降，OGD12 h達(dá)最小值。研究結(jié)果一方面進(jìn)一步證實(shí)了缺血損傷可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞ActA信號(hào)激活，與課題組前期的體內(nèi)外研究結(jié)果相一致[4,8]；而另一方面，本研究結(jié)果也提示了在腦缺血損傷這一病理及病理生理過程中，被誘導(dǎo)激活的ActA信號(hào)強(qiáng)度呈動(dòng)態(tài)變化過程，即其在缺血早期可能介導(dǎo)了短時(shí)程的腦保護(hù)信號(hào)。

腦組織對(duì)缺血性損傷十分敏感，腦局部血流中斷5 min即會(huì)出現(xiàn)腦組織不可逆性損傷[6,7]，因此，本研究結(jié)果可能對(duì)為缺血性腦卒中的治療贏得時(shí)間，從而改善腦梗死患者預(yù)后，提高生活質(zhì)量具有重要意義。另外，本研究結(jié)果證實(shí)了Smad4在介導(dǎo)ActA信號(hào)從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核轉(zhuǎn)導(dǎo)的模式，檢測(cè)方法具有一定創(chuàng)新性。如用傳統(tǒng)的Western-blot蛋白檢測(cè)技術(shù)，需單獨(dú)提取核蛋白，工作復(fù)雜。本研究采用免疫熒光染色技術(shù)對(duì)Smad4(Cy3)及細(xì)胞核(DAPI)進(jìn)行不同標(biāo)記，在激光共聚焦顯微鏡下對(duì)Smad4的空間位移進(jìn)行半定量檢測(cè)，方法簡便易行，提高了檢測(cè)效率及準(zhǔn)確性。

綜上，本研究證實(shí)了OGD損傷可誘導(dǎo)神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞ActA信號(hào)激活，Smad4可通過質(zhì)核移位介導(dǎo)ActA 信號(hào)在受體水平下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且隨時(shí)間延長呈動(dòng)態(tài)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果擴(kuò)展了腦缺血損傷相關(guān)ActA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究思路。但本研究為體外細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)研究，與體內(nèi)真實(shí)環(huán)境尚存在一定差距，尚需在后續(xù)研究中豐富體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

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[3]Mei Chun-li,He Jin-ting,Mang Jing,et al.Nerve growth factor (NGF) combined with oxygen glucose deprivation OGD induces neural ischemia tolerance in PC12 cells [J].African Journal of Biochemistry Research,2011,5(10):315.

[4]莽靖，何金婷，王嬌琦，等.腦缺血損傷ActA與跨膜受體ActRIIA在Smads轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的表達(dá)[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2013,30(1):15.

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[8]He Jin-Ting,Mang Jing,Mei Chun-Li,et al.Neuroprotective Effects of Exogenous Activin A on Oxygen-Glucose Deprivation in PC12 Cells [J].Molecules,2011,17(1):315.

摘要：目的明確OGD損傷誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞激活素A(Activin A， ActA)信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)基于Smad4的轉(zhuǎn)導(dǎo)模式及作用。方法使用鼠神經(jīng)生長因子(NGF，50 ng/ml)誘導(dǎo)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞向神經(jīng)元樣轉(zhuǎn)化，利用無糖DMEM培養(yǎng)液聯(lián)合連二亞硫酸鈉(1 mmol/L)構(gòu)建神經(jīng)元氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，體外模擬神經(jīng)元缺血性損傷。OGD 0、3 h、6 h、12 h后Realtime-PCR檢測(cè)ActA mRNA表達(dá)水平；激光共聚焦觀察免疫熒光染色后的Smad4質(zhì)核分布情況。結(jié)果NGF誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞貼壁并伸出較長的突觸，向神經(jīng)元樣轉(zhuǎn)化。細(xì)胞OGD處理3 h后ActA mRNA表達(dá)水平較0 h顯著升高，6 h開始下降；OGD3 h后Smad4在細(xì)胞核內(nèi)的分布較OGD 0 h明顯增加，6小時(shí)開始下降。結(jié)論OGD損傷可誘導(dǎo)神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞ActA信號(hào)激活，Smad4可通過質(zhì)核移位介導(dǎo)ActA 信號(hào)在受體水平下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且隨時(shí)間延長呈動(dòng)態(tài)變化。

關(guān)鍵詞：腦缺血損傷；激活素A；Smad4

Effects of ActivinA signaling mediated by Smad4 in PC12 cell suffered by OGDYOURu-qin,WANGJiao-qi,LIUHong-yu,etal.(DepartmentofNeurology,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the transduction mechanisms and function of the ActivinA (ActA)signaling based on Smad4 in the oxygen-glucose deprivation (OGD) PC12 cell line.MethodsNerve growth factor (NGF,50ng/ml) was used in this study to induce the differentiation of rattus PC12 pheochromocytoma cells to nerve-like cells.Then the glucose-free DMEM and hyposulfite of Na2S2O4(1 mmol/L) was introduced to cells to construct an OGD model in vitro.The expression of ActA mRNA in OGD 0 h/3 h/6 h/12 h group was abserved by Realtime-PCR.And after immunofluorescence staining,the intranuclear mobility of Smad4 in OGD 0 h/3 h/6 h/12 h group was observed under the confocal laser scanning microscope at 554 nm.ResultsPC12 cell was successfully differentiated into nerve-like cell after NGF exposure.Compared to the group of OGD 0 h，the expression of ActA mRNA in OGD 3 h group was significantly increased，while gradually decreased in OGD 6 h and 12 h group.The fluorescence intensity of Smad4 in nuclei was increased in OGD 3 h group compared to that in OGD 0 h group,and decreased in OGD 6h group.ConclusionOGD injury could activate the ActA signaling in nerve-like PC12 cell line.Smad4 could mediate the tranduction of ActA signaling through cytoplasmic-nuclear translocation.

Key words:Brain ischemia;Activin A;Smad4

收稿日期：(2014-09-24)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R743.3

文章編號(hào)：1007-4287(2015)04-0525-04

通訊作者*

基金項(xiàng)目：國家自然基金面上項(xiàng)目(81371298)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃國際合作項(xiàng)目(20120723);吉林省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目(2013C030-4);吉林大學(xué)白求恩前沿交叉學(xué)科創(chuàng)新項(xiàng)目(2013107028);吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)青年科研基金項(xiàng)目(2013207052)