宗成國(guó),霍紅琳,張　婷,李紅敏

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 大連116001)

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脂聯(lián)素基因SNPs-11377C/G多態(tài)性與女性乳腺癌的相關(guān)性

宗成國(guó),霍紅琳,張婷,李紅敏

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 大連116001)

摘要：目的探討脂聯(lián)素基因SNPs-11377C/G多態(tài)性與女性乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性。方法用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)觀察脂聯(lián)素基因在不同人群中的單核苷酸多態(tài)性，其中包括乳腺癌組患者70人，健康對(duì)照組30人。結(jié)果SNPs-11377C/G等位基因頻率在乳腺癌和正常對(duì)照組間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，乳腺癌患者組CG基因型分布頻率高于GG型和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。乳腺癌組CC基因型CA153與CEA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs-11377C/G基因多態(tài)性與乳腺癌疾病發(fā)生有相關(guān)性。

(ChinJLabDiagn,2015,19:1071)

脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是一種脂肪細(xì)胞特異性高分泌，具有多種功能的細(xì)胞因子，能提高組織對(duì)胰島素敏感性。血漿脂聯(lián)素水平可能與胰島素抵抗、肥胖、胰島素血癥呈負(fù)相關(guān)，另外也與乳腺癌負(fù)相關(guān)[1-3]。最近研究表明低循環(huán)的脂聯(lián)素水平與女性乳腺癌發(fā)病率提高密切相關(guān)，且與年齡、絕經(jīng)情況、體質(zhì)情況等無相關(guān)性。正常人脂聯(lián)素基因序列中存在相當(dāng)數(shù)量的等位基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，但這些密碼子的變化并不改變其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。然而，脂聯(lián)素基因5′ 側(cè)翼區(qū)SNPs-11377C/G的變化，可能直接影響脂聯(lián)素的血漿水平[4]，進(jìn)而影響女性乳腺癌等疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究采用PCR-RFLP技術(shù)分析脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs-11377C/G基因型和等位基因頻率，旨在探討脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs-11377C/G基因多態(tài)性與女性乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性，為開展乳腺癌的基因診斷和基因治療提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1研究對(duì)象來源于2011年至2012年我院普外科因乳腺癌住院患者及我院健康體檢者，分為乳腺癌組和正常對(duì)照組。① 乳腺癌組：70人，臨床已確診的乳腺癌患者。②正常對(duì)照組：30例，健康體檢者。

1.2　研究方法

1.2.1生化指標(biāo)受試者于清晨空腹靜脈取血使用免疫分析儀檢測(cè)癌胚抗原(CEA)、CA153、CA125。

1.2.2脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs-11377C/G基因型多態(tài)性的PCR-RFLP分析

①DNA的提?。喝】崭轨o脈血0.3 ml(EDTA抗凝)用全血DNA提取試劑盒(上海華舜公司)提取基因組DNA。 提取的基因組DNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②PCR擴(kuò)增：從Genebank中查取人apM1基因序列，應(yīng)用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由TaKaRa公司(大連)合成。

上游引物 5′ TGG TGG ACT TGA CTT TAC TGG TAG 3′ ；

下游引物 5′ TAG AAG CAG CCT GGA GAA CTG 3′。

PCR 反應(yīng)體系(25 μl)):模板DNA1.5 μl，上下游引物各1.3 μl，2×Master Mix(TaKaRa大連公司) 12.5 μl，ddH2O 8.4 μl。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 變性1 min，61 ℃ 退火30 sec，72℃延伸1 min，共36個(gè)循環(huán)，完成后72℃ 維持10 min，擴(kuò)增在PCR儀(Thermo公司)上完成。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，產(chǎn)物片段為329 bp。

③酶切：用Hhal(TaKaRa公司)限制性內(nèi)切酶酶切，37℃酶切水解4-16 h,取5 μl酶切產(chǎn)物置2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)酶切結(jié)果。

2結(jié)果

2.1　SNPs-11377C/G基因多態(tài)性3種酶切電泳結(jié)果(見圖1)

以人類基因組DNA為模版，目的基因脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs-11377(C/G)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為329bp,此多態(tài)性位點(diǎn)可被限制性內(nèi)切酶Hhal識(shí)別，酶切產(chǎn)物片段長(zhǎng)度分別為CC(329bp)，CG(329bp;211bp;118bp),GG(211bp;118bp)。

圖1脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs-11377(C/G)酶切電泳。(M：Marker;1、2、3、4、5、6、9：CC基因型；7、8、15、16：CG基因型；13、14：GG基因型)

2.2　SNPs-11377C/G基因型及等位基因頻率分布

以Hardy-Weinber平衡檢驗(yàn)乳腺癌組和正常對(duì)照組的基因型頻率，等位基因的分布具有群體代表性(P>0.05)(見表1)。SNPs-11377C/G等位基因頻率在對(duì)照組和乳腺癌組兩組間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.180；P=0.672)，但CG基因型與GG基因型相較，CG基因型在乳腺癌組的分布頻率高于GG基因型的分布頻率，且與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.649；P<0.05)，其他各基因型間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　乳腺癌組和對(duì)照組SNPs-11377C/G基因型及等位基因頻率分布

2.3　組間腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平的比較

乳腺癌患者的CEA、CA153的均值明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

±s)

2.4　基因型分組臨床資料比較

在乳腺癌組和正常對(duì)照組中均以基因型分組，在對(duì)照組與乳腺癌組內(nèi)，各基因型腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平無顯著性差異，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。乳腺癌組CC基因型CEA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P=0.0133)，CA153的表達(dá)水平高于對(duì)照組(P=0.0072),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約120萬女性發(fā)生乳腺癌。在我國(guó)大中城市中，乳腺癌的發(fā)病率已躍居女性惡性腫瘤的前兩位。

±s)

乳腺癌發(fā)生的高危因素和機(jī)制與肥胖、糖尿病、高血壓、高血脂等因素相關(guān)，乳腺癌為雌激素依賴性腫瘤，雌激素為細(xì)胞有絲分裂的刺激因子，可促進(jìn)癌癥發(fā)生、發(fā)展。乳腺癌的早期診斷對(duì)降低乳腺癌的死亡率有著重要的意義。脂聯(lián)素在調(diào)節(jié)機(jī)體糖和脂肪代謝、維持機(jī)體能量代謝平衡中發(fā)揮著重要作用，且為基因表達(dá)過程中較為豐富的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。脂聯(lián)素分泌失衡與糖、脂肪代謝異常相關(guān)疾病密切相關(guān)[1，5，6]，有報(bào)道認(rèn)為，脂聯(lián)素還可能通過調(diào)節(jié)雌激素-胰島素水平參與乳腺癌的發(fā)生，低脂聯(lián)素可能改變激素與細(xì)胞因子的作用，從而增加了乳腺癌等腫瘤的發(fā)病率[6]，但具體機(jī)制目前尚不清楚。

正常人APN-1基因中存在相當(dāng)數(shù)量的等位基因SNPs，且有較大頻率的基因多態(tài)性，但是密碼子的變化并不改變其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸的序列，染色體3q27區(qū)域同時(shí)存在2型糖尿病，代謝綜合征和冠心病的易感位點(diǎn)[7]，Gu[4]等人的研究表明脂聯(lián)素基因5′ 側(cè)翼區(qū)SNPs-11377C/G等變化可能直接影響脂聯(lián)素的血漿水平，可能與其改變了APN-1基因上游的某些轉(zhuǎn)錄元件有關(guān)[8]。Vasseur[9]等人不僅發(fā)現(xiàn)-11377C/G基因多態(tài)性與2型糖尿病相關(guān)，他們還發(fā)現(xiàn)SNPs-11391G/A或SNPs-11377C/G的基因型決定了糖尿病患者的脂聯(lián)素的水平。在我們的研究中，乳腺癌人群中-11377C/G的等位基因頻率(C=71.4，G=28.6)，與正常對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與國(guó)外報(bào)道的正常人平均基因頻率接近[C=75.4，G=24.6(rs266729,NCBI)]，其原因可能與本研究排除糖尿病患者有關(guān)也可能與我們的樣本量較少有關(guān)。另外，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，在乳腺癌患者中CG基因型分布頻率高于GG型，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示我們，可能在人群中CG基因型對(duì)乳腺癌較GG基因型有較高易感性，說明脂聯(lián)素基因多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)生有相關(guān)性。但要觀察其是否有普遍意義應(yīng)加大樣本量，并觀察這兩組脂聯(lián)素的表達(dá)水平。

在本研究中，乳腺癌人群血脂指標(biāo)明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，葉楓[10]等研究結(jié)果顯示，脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs-11377C/G的G等位基因可能是肥胖的易感基因之一，提示我們?nèi)橄侔┑陌l(fā)生、發(fā)展可能與肥胖有一定的相關(guān)性，且有研究發(fā)現(xiàn)GG基因型舒張壓，收縮壓，甘油三酯均有明顯增高趨勢(shì)。乳腺癌患者血清中CA153與CEA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CA153對(duì)乳癌有較好的敏感性和特異性，被認(rèn)為是乳腺癌的首選腫瘤標(biāo)志物，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系。乳腺癌患者血清CEA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者SNPs-11377CC基因型的CA153與CEA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，提示，SNPs-11377CC型可能參與了乳腺癌的發(fā)展過程。

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關(guān)鍵詞：乳腺癌；脂聯(lián)素；基因多態(tài)性

Association of SNPs-11377C/G in proximal promoter region of adiponectin gene with breast cancer for femaleZONGCheng-guo,HUOHong-lin,ZHANGTing,etal.(ZhongshanHospitalAffiliatedtoDalianUniversity,Dalian116001,China)

Abstract:ObjectiveTo study the association of SNPs-11377C/G in proximal promoter region of adiponectin gene with breast cancer for female.MethodsThe PCR-RFLP techniques were adopted to test SNPs in the proximal promoter region of the APM1 gene in 30 normal control group and 70 breast cancer group.ResultsThere were no significant difference of the distribution of the Gensini coronary scores in the two groups(P>0.05).The frequencies of CG were higher than GG in breast cancer compared with normal.In breast cancer group,serum CA153 and CEA level of GG genotype and CC genotype at position-11377 were significantly higher than in control group(P<0.05).ConclusionThe results suggest that SNPs-11377C/G in proximal promoter region of adiponectin gene may contribute to the risk of breast cancer for female.

Key words:breast cancer；adiponectin；gene polymorphism

(收稿日期：2014-05-26)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R737.9

文章編號(hào)：1007-4287(2015)07-1071-03