siRNA干擾PDCD4表達(dá)對(duì)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Eca109的影響

任麗華1邱洪清1盧亞萍1劉健1施瑞華2*

蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院消化內(nèi)科1(215600)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科2

背景：研究發(fā)現(xiàn)PDCD4是一種新的腫瘤抑制基因，其表達(dá)與多種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。然而，PDCD4在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用尚未完全明確。目的：探討沉默PDCD4表達(dá)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Eca109體外增殖、遷移、凋亡能力的影響。方法：選擇未轉(zhuǎn)染的Eca109細(xì)胞(空白對(duì)照組)、轉(zhuǎn)染無義序列的Eca109細(xì)胞(陰性對(duì)照組)和轉(zhuǎn)染PDCD4 siRNA的Eca109細(xì)胞(si-PDCD4組)，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測PDCD4蛋白表達(dá)，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，平板單克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。結(jié)果：與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，si-PDCD4組細(xì)胞中PDCD4蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P<0.05)，細(xì)胞克隆形成數(shù)目增多(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論：PDCD4 siRNA可在體外促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞的增殖、遷移，并抑制細(xì)胞凋亡，為食管鱗狀細(xì)胞癌的診治提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞PDCD4；RNA，小分子干擾；食管腫瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞遷移

Cell Migration

程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death 4, PDCD4)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，有研究認(rèn)為其表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)PDCD4可能成為潛在的抗腫瘤治療靶標(biāo)[3]。目前國內(nèi)尚缺乏針對(duì)PDCD4基因具體功能的研究，其對(duì)ESCC的體外作用亦尚未完全明確。本研究通過采用小分子干擾RNA(siRNA)技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人ESCC細(xì)胞株Eca109，旨在探討PDCD4對(duì)ESCC細(xì)胞生長的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

ESCC細(xì)胞株Eca109(購自上海細(xì)胞研究所)用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、siRNA轉(zhuǎn)染

Eca109細(xì)胞按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，然后分為si-PDCD4組、陰性對(duì)照組(NC組)，分別轉(zhuǎn)染PDCD4 siRNA和無義序列，以未轉(zhuǎn)染的Eca109細(xì)胞作為空白對(duì)照組(Mock組)。根據(jù)說明書步驟采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑(美國Invitrogen公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6 h更換新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育48 h。si-PDCD4序列：正義鏈5′-GUG UUG GCA GUA UCC UUA G-3′，反義鏈5′-CUA AGG AUA CUG CCA ACA ACT T-3′；陰性對(duì)照序列：正義鏈5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，反義鏈5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′；轉(zhuǎn)染序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

三、蛋白質(zhì)印跡法

常規(guī)提取三組ESCC細(xì)胞中的蛋白。取50 μg蛋白行10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，加5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h后，加入PDCD4一抗(工作濃度1∶1 000，美國Cell Signaling Technology公司)后 4 ℃搖床過夜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，洗膜，曝光，顯影。以GAPDH(工作濃度為1∶3 000，美國Santa Cruz公司)作為內(nèi)參照。

四、CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染48 h后將三組細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔3 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別于接種后24、48、72、96 h加入CCK-8試劑10 μL/孔(碧云天生物技術(shù)研究所)，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的吸光度值(A值)。

五、平板單克隆形成實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染48 h后，三組細(xì)胞按300/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)7 d后以PBS緩沖液沖洗，4%甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色20 min，自來水輕輕沖洗。于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)目，每組細(xì)胞重復(fù)3次。

六、流式細(xì)胞術(shù)

轉(zhuǎn)染48 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，以250 μL 稀釋的混合緩沖液重懸細(xì)胞，使其濃度調(diào)整為1×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液置于流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC溶液和10 μL碘化丙啶(PI)溶液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，混勻后于室溫避光放置15 min，在反應(yīng)中加400 μL PBS，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

七、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染48 h后，分別將三組1×105個(gè)細(xì)胞加至Transwell小室上室內(nèi)(美國Corning)，下室內(nèi)加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，取出小室，以乙醇固定，結(jié)晶紫染色，然后用棉簽小心擦除小室上的細(xì)胞，于高倍鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、PDCD4蛋白表達(dá)水平

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，si-PDCD4組、NC組、Mock組Eca109細(xì)胞中PDCD4蛋白表達(dá)分別為0.63±0.05、1.13±0.06、1.14±0.06，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.04，P<0.05)；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，si-PDCD4組PDCD4蛋白表達(dá)顯著低于NC組和Mock組(t=14.72，P<0.05；t=15.54，P<0.05)，而NC組與Mock組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.15，P>0.05)(圖1)。

二、細(xì)胞增殖能力變化

CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h、72 h、96 h后，si-PDCD4組、NC組、Mock組的A值分別為0.46±0.03、0.38±0.04、0.39±0.02，0.59±0.01、0.46±0.01、0.43±0.01和1.09±0.00、0.84±0.02、0.80±0.00，組間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.06，P<0.05；F=21.76，P<0.05；F=19.69，P<0.05)；進(jìn)一步兩兩比較分析發(fā)現(xiàn)，si-PDCD4組A值與NC組或Mock組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而NC組與Mock組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，si-PDCD4組的A值在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h這四個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.86，P<0.05)，四個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖1各組Eca109細(xì)胞PDCD4蛋白表達(dá)情況(蛋白質(zhì)印跡法)

圖2　各組細(xì)胞增殖能力分析(CCK-8實(shí)驗(yàn))

三、細(xì)胞克隆形成能力

單克隆平板形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)7 d后，si-PDCD4組、NC組、Mock組的細(xì)胞克隆形成數(shù)目分別為213.8±16.5、115.6±9.1、106.8±8.6，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.97，P<0.05)；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，si-PDCD4組細(xì)胞克隆形成數(shù)目顯著高于NC組和Mock組(t=7.80，P<0.05；t=11.90，P<0.05)，而NC組與Mock組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.42，P>0.05)(圖3)。

四、細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，si-PDCD4組、NC組、Mock組細(xì)胞凋亡率分別為20.83%±0.61%、44.33%±3.69%、15.03%±2.23%，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=107.70，P<0.05)；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，si-PDCD4組細(xì)胞凋亡率顯著低于NC組(t=11.71，P<0.05)，但顯著高于Mock組(t=5.29，P<0.05)，而NC組與Mock組相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.25，P<0.05)(圖4)。

五、細(xì)胞遷移能力

Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染72 h后，si-PDCD4組、NC組、Mock組的細(xì)胞遷移數(shù)目分別為449.0±42.0、201.3±12.0、214.3±5.5，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.87，P<0.05)；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，si-PDCD4組細(xì)胞遷移能力顯著高于NC組和Mock組(t=9.80，P<0.05；t=7.90，P<0.05)，而NC組與Mock組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.67,P>0.05)(圖5)。

討論

PDCD4最初是在細(xì)胞凋亡過程中被發(fā)現(xiàn)的，定位于染色體10q24，編碼185個(gè)氨基酸。PDCD4具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可通過作用于轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄起始因子eIF4A和eIF4G，抑制蛋白翻譯，從而抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[4-6]。越來越多的研究表明PDCD4可調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，是一種腫瘤抑制因子。

Afonja等[7]的研究發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)過表達(dá)PDCD4蛋白的乳腺癌細(xì)胞凋亡率明顯增加且細(xì)胞增殖能力受到抑制。Bitomsky等[8]利用shRNA技術(shù)穩(wěn)定干擾宮頸癌HeLa細(xì)胞中PDCD4表達(dá)后，HeLa細(xì)胞中p21Waf1/Cip1、p53等諸多促癌基因的表達(dá)激活，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)UV射線的凋亡率降低。Jansen等[9]利用轉(zhuǎn)基因小鼠過表達(dá)PDCD4后，發(fā)現(xiàn)突變型小鼠的乳頭瘤形成能力較野生型小鼠顯著減弱，這一作用可能是通過抑制活化蛋白-1(AP-1)而實(shí)現(xiàn)的。國內(nèi)有研究[10]通過蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化法證實(shí)PDCD4在胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌組織中的表達(dá)降低，且與腫瘤分化程度密切相關(guān)；提高PDCD4蛋白表達(dá)后，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，從而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。上述研究結(jié)果高度提示PDCD4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用。已有研究顯示PDCD4 mRNA和蛋白表達(dá)在ESCC組織中明顯降低[1-2]，但其對(duì)ESCC細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制尚未見相關(guān)報(bào)道。

圖3　各組細(xì)胞單克隆形成能力分析(平板單克隆形成實(shí)驗(yàn))

圖4　各組細(xì)胞凋亡率比較(流式細(xì)胞術(shù))

圖5　各組細(xì)胞遷移能力分析(Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn))

本研究利用RNA干擾技術(shù)有效降低ESCC細(xì)胞Eca109中PDCD4蛋白表達(dá)， 通過體外功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PDCD4低表達(dá)對(duì) Eca109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移能力的影響。抑制Eca109細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)、凋亡率明顯降低、遷移能力明顯增強(qiáng)，故推測PDCD4對(duì)ESCC細(xì)胞的生長可能發(fā)揮抑癌基因的作用，但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

研究[11-12]發(fā)現(xiàn)miR-21可抑制PDCD4的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)PDCD4是miR-21的靶基因之一。Akt可直接磷酸化PDCD4誘導(dǎo)其降解，且Akt可通過誘導(dǎo)miR-21表達(dá)進(jìn)而在翻譯水平抑制PDCD4表達(dá)[13]。目前已研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNA可共同調(diào)控同一靶基因。本課題的前期研究[14]發(fā)現(xiàn)ESCC組織中miR-183表達(dá)明顯增高，PDCD4 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-183可靶向結(jié)合于PDCD4 mRNA的3’-非翻譯區(qū)，即miR-183與PDCD4之間存在靶向調(diào)控關(guān)系，miR-183在ESCC細(xì)胞中可靶向抑制PDCD4的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)RNA技術(shù)沉默PDCD4表達(dá)后，Eca109細(xì)胞增殖、遷移能力增強(qiáng)，推測PDCD4在ESCC細(xì)胞中可能受miR-183的負(fù)調(diào)控，進(jìn)而參與ESCC的發(fā)生、發(fā)展。當(dāng)然亦有多項(xiàng)研究認(rèn)為miR-21在ESCC細(xì)胞中對(duì)PDCD4的負(fù)調(diào)控作用影響腫瘤的增殖、侵襲[15-16]，而miR-183與miR-21在ESCC細(xì)胞中的相互作用尚需進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)PDCD4 siRNA可促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖、遷移，并抑制細(xì)胞凋亡，從分子機(jī)制上為ESCC的發(fā)生提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為ESCC的靶向治療提供了新靶點(diǎn)。

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(2014-08-25收稿)

Effect of PDCD4 Targeted siRNA Interference on Human Esophageal Squamous Cell Carcinoma Cell Line Eca109RENLihua1,QIUHongqing1,LUYaping1,LIUJian1,SHIRuihua2.1DepartmentofGastroenterology,ZhangjiagangFirstPeople’sHospital,AffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince(215600);2DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing

Correspondence to: SHI Ruihua, Email: ruihuashi@126.com

Background: PDCD4 is a new tumor suppressor gene, and its expression is related to the malignant transformation of many tumors. However, its role in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) has not been fully clarified. Aims: To study the effect of PDCD4 silencing on proliferation, migration, apoptosis of ESCC cell line Eca109invitro. Methods: Eca109 cells were divided into three groups: non-transfected Eca109 cells (blank control group), Eca109 cells transfected with nonsense sequence (negative control group) and Eca109 cells transfected with PDCD4 siRNA (si-PDCD4 group). Expression of PDCD4 protein was detected by Western blotting. Cell proliferation was determined by CCK-8 assay, cell clone was determined by colony-forming assay, flow cytometry was used to determine cell apoptosis, and cell migration was measured by Transwell migration assay. Results: Compared with blank control group and negative control group, expression of PDCD4 protein was significantly reduced (P<0.05), cell proliferation was significantly increased (P<0.05), colony-forming was significantly increased (P<0.05), apoptosis rate was significantly decreased (P<0.05), and migration was significantly increased in si-PDCD4 group (P<0.05). Conclusions: siRNA targeting PDCD4 can promote Eca109 cell proliferation and migration, and inhibit cell apoptosisinvitro, which provides a new evidence for studying the diagnosis and treatment of ESCC.

Key wordsPDCD4;RNA, Small Interfering;Esophageal Neoplasms;Cell Proliferation;Apoptosis;

通信作者*本文，Email: ruihuashi@126.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.02.006