彭方毅綜述，李 波審校

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000）

肝缺血再灌注損傷機(jī)制及相應(yīng)保護(hù)措施的研究進(jìn)展

彭方毅綜述，李 波審校

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000）

再灌注損傷； 肝細(xì)胞； 線粒體； 保護(hù)措施

肝缺血再灌注損傷（HIRI）的具體機(jī)制仍處在研究階段，包括鈣超載線粒體通透轉(zhuǎn)換孔道、氧化應(yīng)激、缺血再灌注損傷相關(guān)炎癥因子、核轉(zhuǎn)錄因子、熱休克蛋白、一氧化氮等。缺血再灌注損傷（IRI）是目前臨床上常見的問題，進(jìn)一步了解IRI機(jī)制，以及運(yùn)用合適的方法去預(yù)防、治療IRI仍然是研究熱點(diǎn)。本文結(jié)合近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，就缺血再灌注損傷的機(jī)制及與其相關(guān)的保護(hù)措施的研究進(jìn)展做一綜述。

1 線粒體損傷及相應(yīng)保護(hù)措施

肝細(xì)胞發(fā)生IRI時(shí)，線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔道（mPTP）在細(xì)胞凋亡的過程中起著關(guān)鍵作用。Bcl-2家族蛋白等許多因子作用于線粒體，使線粒體膜上的通透性改變孔開放，繼而造成線粒體跨膜電位降低甚至崩解并釋放細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子等促凋亡因子，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激產(chǎn)物氧自由基（ROS）、低氧狀態(tài)、能量抑制狀態(tài)及高濃度的Ca2+等多種因素均可以誘導(dǎo)mPTP開放，然而細(xì)胞內(nèi)pH降低及環(huán)孢素A（CsA）可以抑制mPTP開放[1-2]。

顯然細(xì)胞損傷程度與mPTP開放的程度呈正相關(guān)，能夠通過某種方式抑制mPTP開放就可能減輕IRI。研究發(fā)現(xiàn)mPTP受親環(huán)素蛋白D（CypD）調(diào)控，能夠特異結(jié)合CsA，并且發(fā)現(xiàn)CsA能夠有效抑制mPTP開放，對線粒體起到一定的保護(hù)作用，IRI的動物模型中起到了保護(hù)作用[3]。國內(nèi)對CsA深入研究發(fā)現(xiàn)，CsA的治療作用與其劑量相關(guān)，高濃度的CsA反而會抑制線粒體功能，認(rèn)為5 mg/kg是最適宜的劑量[4]。

2 氧化應(yīng)激及相應(yīng)保護(hù)措施

在生理情況下，體內(nèi)有少部分的氧參與到氧化反應(yīng)，產(chǎn)生少量的ROS，但此時(shí)人體內(nèi)存在大量抗氧化物質(zhì)，然而當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注（I/R）時(shí)，ROS生成過多以致機(jī)體平衡打破。ROS主要來源有：黃嘌呤氧化酶途徑，庫普弗細(xì)胞（KCs），中性粒細(xì)胞，吞噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，以及有氧呼吸鏈功能障礙等。過量的ROS可造成脂質(zhì)過氧化，DNA氧化及酶變性[5]。除此之外過量的ROS可以使大量的白細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血小板聚集到肝臟的循環(huán)中，致使肝臟發(fā)生微循環(huán)障礙。

抗氧化物、抗氧化能力、抗氧化的信號通路等都是目前研究的方向。Schauer等[6]發(fā)現(xiàn)給予谷胱甘肽（GSH）超過100μmol/（h·kg）時(shí)候，對于肝缺血在灌注損傷有相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用。N-乙酰半胱氨酸與親電子的氧化基團(tuán)直接發(fā)生作用的自由巰基（親核的巰基）而發(fā)揮直接抗氧化作用[7]。Masuda等[8]通過dh404誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子（Nrf2）對動物進(jìn)行缺血預(yù)處理，證實(shí)該通路可以減輕HIRI。Nrf2可以誘導(dǎo)抗氧化蛋白生成，在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的過程中發(fā)揮重要作用，Nrf2誘導(dǎo)物可能成為有潛力的藥物[9]。Yu等[10]研究中發(fā)現(xiàn)通過高壓氧療可以增加細(xì)胞的抗氧化能力。

3 鈣超載及相應(yīng)保護(hù)措施

在IRI的病理過程中，由于細(xì)胞在缺血缺氧過程中，細(xì)胞的生理平衡被打破，細(xì)胞能量供給不足，ATP急劇減少，導(dǎo)致能量因依賴的Na+-K+-ATP酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)Na+增多，細(xì)胞通過Na+-Ca2+離子交換彌補(bǔ)離子交換不足，以維持膜電位，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+大量增多；此外Ca2+-ATP/Ca2+-Mg2+-ATP酶功能障礙，細(xì)胞不能將多余的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，進(jìn)一步導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增多。鈣超載可以從多個(gè)方面損傷細(xì)胞：促使ROS增多、激活炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、破壞細(xì)胞膜、干擾線粒體功能等[11]。

Nauta等[12]在動物建立缺血再灌注模型前給予維拉帕米預(yù)處理，肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+的聚集受到明顯抑制。線粒體ATD敏感鉀通道（mitoKATP）和mPTP的差異影響了線粒體內(nèi)Ca2+的平衡，誘導(dǎo)mitoKATP開放使線粒體膜部分去極化和抑制mPTP都可以減少Ca2+內(nèi)流，從而減輕鈣超載[13]。Lv等[14]使用Na+-Ca2+交換抑制劑KB-R7943，發(fā)現(xiàn)該抑制劑可以有效地抑制細(xì)胞凋亡，并且可以激活K+-ATP通道，促進(jìn)K+和Ca2+交換，抑制鈣超載。

4 炎癥細(xì)胞激活及相應(yīng)保護(hù)措施

HIRI可激活KCs。激活的KCs主要通過以下途徑發(fā)揮作用：激活的KCs釋放腫瘤壞死因子（TNF-α）及炎癥因子（IL-1、IL-6、IL-12、IL-23）。TNF-α和IL-1增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)黏附因-1（ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達(dá)，促進(jìn)多形核白細(xì)胞（PMN）的趨化、黏附和遷移，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集于肝內(nèi)及血管內(nèi)皮細(xì)胞 （EC）損傷，從而引起微循環(huán)障礙，損傷肝組織。不僅如此，激活的KCs以及被趨化、激活的PMN還可以釋放ROS損傷肝組織[15]。PMN通過NADPH途徑產(chǎn)生活性氧代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷甚至凋亡；PMN可以釋放彈性蛋白酶、組織蛋白酶等損傷肝組織；在PMN表達(dá)的選擇素和整合素，以及EC所表達(dá)的ICAM-1、VCAM-1的影響下，PMN和EC之間黏附增強(qiáng)，導(dǎo)致的PMN大量聚集到肝內(nèi)，可使血液黏度增加，阻塞微血管，造成血流阻力增加[16]。

Argenbright等[17]發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附一定程度上可以被白細(xì)胞質(zhì)膜上所表達(dá)的CD11/ CD18糖蛋白和內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)的ICAM-1調(diào)節(jié)的，使用相應(yīng)的單克隆抗體可以一定程度上減少細(xì)胞間黏附，改善炎性反應(yīng)和微循環(huán)。Tolba等[18]通過使用選擇性COX-2抑制劑和KCs的抑制物GdCl3在IR前24 h給藥預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)二者均可以減少TNF-α，保護(hù)肝細(xì)胞。Kitagawa等[19]對BCAA是否對IRI有保護(hù)作用進(jìn)行了探索性的研究，發(fā)現(xiàn)BCAA可以減輕I/R對肝功能的損傷，減少黏附分子和ET-1的表達(dá)，還可以降低門靜脈壓力，減輕PMN黏附，改善肝臟微循環(huán)；同時(shí)還單獨(dú)分離和培養(yǎng)了KCs用不同劑量的BCAA進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示IL-1β、IL-6和ET-1均減少，而且與BCAA劑量跟反比。結(jié)果支持在圍術(shù)期使用BCAA用于治療I/R損傷。

5 炎癥介質(zhì)的作用及相應(yīng)保護(hù)措施

細(xì)胞因子在HIRI過程中，發(fā)揮著促炎和抗炎的雙重作用。炎癥因子主要由KCs、PMN、內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生，包括TNF-α、IL-1、IFN-γ、IL-6、IL-10、HGF、VEGF等。TNF-α可以激活和趨化PMN，可以激活NF-кB、絲裂原活化蛋白激酶，造成細(xì)胞凋亡，還可以誘導(dǎo)ROS產(chǎn)物，加重IRI；IL-1作為最主要的促炎癥因子，也可以激活NF-кB和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白（MIP-2），進(jìn)一步誘導(dǎo)KCs產(chǎn)生TNF-α等加速炎性反應(yīng)，并且招募PMN產(chǎn)生更多的ROS和蛋白酶，損傷肝組織；IFN-γ主要是T細(xì)胞和NKT細(xì)胞產(chǎn)生，其可以誘導(dǎo)誘發(fā)型NO合成酶（iNOS）產(chǎn)生，還可以調(diào)節(jié)PMN的招募和激活，參與到I/R過程，其具體作用與其劑量相關(guān)；IL-6一般被認(rèn)為是促炎因子，其與gp130相結(jié)合，可以通過STAT3通路發(fā)揮抗炎作用，可以下調(diào)IL-1和TNF-α的合成，同時(shí)還能抑制IFN-γ、GM-CSF及MIP-2，還可以增加GSH的產(chǎn)生，對抗氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的損傷；IL-10作為目前研究較多的抗炎因子，被認(rèn)為是最重要的抗炎因子，可以抑制炎癥細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-2），還具有抑制KCs促炎因子的表達(dá)、NF-кB的激活以及抑制IL-1、IL6、IL-12、MIP-2等的作用，IL-10是I/R損傷潛在的治療點(diǎn)；VEGF通過絡(luò)氨酸激酶途徑發(fā)揮作用，通過上調(diào)TNF-α、IFN-γ及MIP-1等促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集，導(dǎo)致I/R損傷；HGF可以促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，下調(diào)ICAM-1并抑制PMN聚集發(fā)揮保護(hù)作用[15，20]。目前對于細(xì)胞因子相關(guān)治療的研究不少，比如白介素-1受體拮抗劑（IL-1ra）、TNF-α抑制劑等。

6 核轉(zhuǎn)錄因子的作用及相應(yīng)護(hù)措施

NF-кB是二聚體，一般是p50和p65。正常KCs中，NF-кB處在未激活狀態(tài)下，與其抑制蛋白I-кB形成的復(fù)合物。HIRI時(shí)，NF-кB通過多種途徑被激活：NF-кB激活的經(jīng)典途徑，I-кB被其激酶復(fù)合物磷酸化，隨后降解；不依耐IKK復(fù)合物（I-кB激酶）途徑，I-кBa酪氨酸殘基磷酸化，NF-кB被激活。被激活的NF-кB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并激活靶基因轉(zhuǎn)錄，從而參與HIRI。NF-кB通過調(diào)控NOS，細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1），趨化因子（ENA78），ICAM-1等發(fā)揮效應(yīng)。Matsui等[21]在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NF-кB的激活與I/R是相關(guān)的，并且使用NF-кB抑制物干預(yù)缺血再灌注可以有效減輕IRI。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)寡聚脫氧核苷酸（ODNs）通過抑制NF-кB的激活和炎癥介質(zhì)的表達(dá)從而達(dá)到保護(hù)大鼠原位肝移植術(shù)后IRI。

7 一氧化氮作用及相應(yīng)保護(hù)措施

NO由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，其反應(yīng)過程由NO合酶（NOS）催化。NOS包括3種形式：神經(jīng)型NO合成酶（nNOS）、iNOS及內(nèi)皮型NO合成酶（eNOS），其在肝內(nèi)存在形式是后2型。NO在HIRI時(shí)作用有：阻止體內(nèi)抗氧化劑的減少，減輕氧化應(yīng)激損傷；對抗內(nèi)皮素（ET）的有害作用；改善微循環(huán)。Peralta等[23]在IRI動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)NO對于肝功能的改善相當(dāng)明顯同時(shí)改善肝血流灌注，還發(fā)現(xiàn)腺苷可以刺激NO產(chǎn)生發(fā)揮IRI保護(hù)作用。Lang等[24]在1個(gè)小樣本的前瞻性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用NO吸入劑可以有效地保護(hù)肝移植后肝細(xì)胞，加速移植后肝功能的恢復(fù)，縮短患者住院時(shí)間。

8 熱休克蛋白的作用及相應(yīng)保護(hù)措施

血紅素氧化酶（HO）是血紅素分解代謝過程中的限速酶，分為3種類型：誘導(dǎo)型（HO-1）、組成型（HO-2）及發(fā)現(xiàn)不久的HO-3。目前研究較多的是HO-1，也稱熱休克蛋白32（HSP32），可以通過激活Nrf2達(dá)到抗氧化作用，其分解的產(chǎn)物膽綠素也具有抗氧化作用。有研究表明HO-1含量增加，可以使增加細(xì)胞外SOD和H2O2酶含量，使用HO-1拮抗劑可以使SOD和H2O2含量下降；HO-1還可以抗細(xì)胞凋亡，主要通過抗凋亡通路bcl-2和可溶性鳥苷酸環(huán)化酶來達(dá)到細(xì)胞保護(hù)的作用；HO-1分解血紅素所產(chǎn)生的CO能保護(hù)EC，舒張血管平滑肌及抗血小板聚集改善微循環(huán)；另外HSP70也可以通過激活Nrf2通路參與HIRI保護(hù)[25-26]。

9 展 望

總結(jié)目前研究所知，可以從多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對IRI進(jìn)行干預(yù)：缺血預(yù)處理，缺血中處理，缺血后處理；也可以從多個(gè)方面對IRI進(jìn)行干預(yù)：抗氧化應(yīng)激、抗炎癥因子、抑制細(xì)胞因子、改善微循環(huán)、改善能量代謝、調(diào)節(jié)信號通路等；研究過程中還有多種方法：常見藥物、單克隆抗體、信號通路抑制劑、細(xì)胞因子拮抗劑、基因敲除、RNA干擾等。這些思路和方法大多數(shù)還在科學(xué)研究階段，但是已初見成效，在不斷研究HIRI機(jī)制的同時(shí)進(jìn)一步提出更多、更好的保護(hù)方法，保證其能有效的、安全的用于臨床是未來將要完成的工作。

[1]Costantini P，Belzacq AS，Vieira HL.Oxidation of a critical thiol residue of the adenine nucleotide translocator enforces Bcl-2-independent permeability transition pore opening and apoptosis[J].Oncogene，2000，19（2）：307-314.

[2]Kim B，Takeuchi A，Koga O，et al.Mitochondria Na（+）-Ca（2+）exchange in cardiomyocytes and lymphocytes[J].Adv Exp Med Biol，2013，961：193-201.

[3]Halestrap AP，Richardson AP.The mitochondrial permeability transition：A current perspective on its identity and role in ischaemia/reperfusion injury[J].J Mol Cell Cardiol，2015，78：129-141.

[4]雷艷.抑制線粒體MPTP開放對大鼠重要器官缺血缺氧損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2013.

[5]Jaeschke H.Role of reactive oxygen species in hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning[J].J Invest Surg，2003，16（3）：127-140.

[6]Schauer RJ，Gerbes AL，Vonier D，et al.Glutathione protects the rat liver against reperfusion injury after prolonged warm ischemia[J].Ann Surg，2004，239（2）：220-231.

[7]Baumann J，Ghosh S，Szakmany J，et al.Short-term effects of N-acetylysteine and ischemic preconditioning in a canine model of hepatic ischemiareperfusion injury[J].Eur Surg Res，2008，41（2）：226-230.

[8]Masuda Y，Vaziri ND，Takasu C，et al.Salutary effect of pre-treatment with an Nrf2 inducer on ischemia reperfusion injury in the rat liver[J]. Gastroenterol Hepatol（Que），2014，1（1）：1-7.

[9]Ansari N，Khodagholi F，Amini M.2-Ethoxy-4，5-diphenyl-1，3-oxazine-6-one activates the Nrf2/HO-1 axis and protects against oxidative stressinduced neuronal death[J].Eur J Pharmacol，2011，658（2/3）：84-90.

[10]Yu SY，Yoon BR，Lee YJ，et al.Inhibitory effect of high temperature-and high pressure-treated red ginseng on exercise-induced oxidative stress in ICR mouse[J].Nutrients，2014，6（3）：1003-1015.

[11]岳媛媛，馮志杰.肝臟缺血再灌注損傷與鈣超載[J].世界華人消化雜志，2008，16（32）：3654-3658.

[12]Nauta RI，Tsimoyiannis E，Uribe M，et al.The role of calcium ions and calcium channel entry blockers in experimental ischemia-reperfusion-induced liver injury[J].Ann Surg，1991，213（2）：137-42.

[13]Roseborough G，Gao DQ，Chon L et al.The mitochondrial K-ATP channel opener，diazoxide，prevents ischemia-reperfusion injury in the rabbit spinal cord[J].Am J Pathol，2006，168（5）：1443-1451.

[14]Lv Y，Ren Y，Sun L，et al.Protective effect of Na（+）/Ca（2+）exchange blocker KB-R7943 on myocardial ischemia-reperfusion injury in hypercholesterolemic rats[J].Cell Biochem Biophys，2013，66（2）：357-363.

[15]Guan LY，F(xiàn)u PY，Li PD，et al.Mechanisms of hepatic ischemiareperfusion injury and protective effects of nitric oxide[J].World J Gastrointest Surg，2014，6（7）：122-128.

[16]Teoh NC，F(xiàn)arrell GC.Hepatic ischemia reperfusion injury：pathogenic mechanisms and basis for hepatoprotection[J].J Gastroenterol Hepatol，2003，8（8）：891-902.

[17]Argenbright LW，Letts LG，Rothlein R.Monoclonal antibodies to the leukocyte membrane CD18 glycoprotein complex and to intercellular adhesion molecule-1 inhibit leukocyte-endothelial adhesion in rabbits[J].J Leukoc Biol，1991，49（3）：253-257.

[18]Tolba RH，F(xiàn)et N，Yonezawa K，et al.Role of preferential cyclooxygenase-2 inhibition by meloxicam in ischemia/reperfusion injury of the rat liver[J]. Eur Surg Res，2014，53（1/4）：11-24.

[19]Kitagawa T，Yokoyama Y，Kokuryo T，et al.Protective effects of branchedchain amino acids on hepatic ischemia-reperfusion-induced liver injury in rats：a direct attenuation of Kupffer cell activation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2013，304（4）：G346-355.

[20]Tukhovskaya EA，Turovsky EA，Turovskaya MV，et al.Anti-inflammatory cytokine interleukin-10 increases resistance to brain ischemia through modulation of ischemia-induced intracellular Ca2+response[J].Neurosci Lett，2014，571：55-60.

[21]Matsui N，Kasajima K，Hada M，et al.Inhibiton of NF-kappaB activation during ischemia reduces hepatic ischemia/reperfusion injury in rats[J].J Toxicol Sci，2005，30（2）：103-110.

[22]Xu MQ，Shuai XR，Yan ML，et al.Nuclear factor-kappa B decoy oligodeoxynucleotides attenuates ischemia/reperfusion injury in rat liver graft[J]. World J Gastroenterol，2005，28，11（44）：6960-6967.

[23]Peralta C，Hotter G，Closa D，et al.Protective effect of preconditioning on the injury associated to hepatic ischemia-reperfusion in the rat：role of nitric oxide and adenosine[J].Hepatology，1997，25（4）：934-937.

[24]Lang JD，Teng X，Chumley P，et al.Inhaled NO accelerates restoration of liver function in adults following orthotopic liver transplantation[J].J Clin Invest，2007，117：2583-2591.

[25]Jaeschke H，Woolbright BL.Current strategies to minimize hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting reactive oxygen species[J].Transplant Rev（Orlando），2012，26（2）：103-114.

[26]Origassa CS，Camara NO.Cytoprotective role of heme oxygenase-1 and heme degradation derived end products in liver injury[J].World J Hepatol，2013，5（10）：541-549.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.12.023

:A

:1009-5519（2015）12-1821-03

2015-03-14）

彭方毅（1987-），男，四川瀘州人，在讀碩士研究生，主要從事肝膽外科臨床和科研工作；E-mail：494653428@qq.com。

李波（E-mail：liboer2002@126.com）。