田 靜，李 奇，聞琍毓

(江蘇省揚(yáng)州藥品檢驗(yàn)所，揚(yáng)州 225009)

?

藥品質(zhì)量與檢驗(yàn)

心可寧膠囊中非法添加物金橙Ⅱ和樟腦的檢測(cè)研究

田 靜，李 奇，聞琍毓

(江蘇省揚(yáng)州藥品檢驗(yàn)所，揚(yáng)州 225009)

目的：建立心可寧膠囊中非法添加物金橙Ⅱ及樟腦的檢測(cè)方法。方法：采用TLC、HPLC和LC-MS/MS法檢測(cè)金橙Ⅱ；采用GC法檢測(cè)樟腦。結(jié)果：金橙Ⅱ濃度在6.75～33.75 μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率為97.52%，RSD為1.3%(n=6)；樟腦濃度在3.2～980.1 μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r=1)，平均回收率為101.33%，RSD為1.9%(n=6)。結(jié)論：本文所建立方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，可用于檢測(cè)心可寧膠囊中的非法添加物金橙Ⅱ及樟腦。

心可寧膠囊，金橙Ⅱ，樟腦，薄層色譜法，高效液相色譜法，氣相色譜法

心可寧膠囊由丹參、三七、紅花、蟾酥、水牛角濃縮粉、牛黃、人參須、冰片等8味中藥組成，具有活血散瘀、開(kāi)竅止痛功能，用于冠心病、心絞痛、胸悶、心悸、眩暈等癥。近年來(lái)紅花存在用金橙Ⅱ染色現(xiàn)象[1]，有的廠家不重視原材料入廠檢驗(yàn)，致使紅花原藥材中非法添加的金橙Ⅱ色素被帶入到成藥中。另外，在日常監(jiān)督檢查過(guò)程發(fā)現(xiàn)有企業(yè)使用樟腦殘留不合格的劣質(zhì)冰片為原料，甚至有以樟腦代替冰片投料的現(xiàn)象。針對(duì)心可寧膠囊中這兩種非處方成分添加物，本文建立了采用TLC法及HPLC法檢查心可寧膠囊中金橙Ⅱ、采用GC法測(cè)定心可寧膠囊中樟腦的含量的方法，為制訂心可寧膠囊補(bǔ)充檢驗(yàn)方法提供依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 WATERS E 2695型高效液相色譜儀；Agilent 7890A型氣相色譜儀；Sartorius CP225D電子分析天平；薄層板為硅膠G板[10 cm×20 cm，批號(hào)2006323(青島海洋化工分廠)]。

1.2 試藥 對(duì)照藥材紅花(批號(hào)120907-200609)、對(duì)照試劑金橙Ⅱ(批號(hào)111769-200701)、對(duì)照品樟腦(批號(hào)110747-201008)及冰片(批號(hào)110743-200905)均來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純，丙酮、乙醇等為分析醇，水為純化水。心可寧膠囊樣品A～G來(lái)源于7個(gè)不同的生產(chǎn)廠家，其中樣A～樣F用于心可寧膠囊中金橙Ⅱ的檢測(cè)方法研究，樣A～樣E為金橙Ⅱ陽(yáng)性樣品，樣F為金橙Ⅱ陰性正常樣品；樣B、樣C、樣F、樣G用于心可寧膠囊中樟腦的檢測(cè)方法研究，其中樣B、樣C、樣G為樟腦陽(yáng)性樣品，樣F為樟腦陰性正常樣品。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 心可寧膠囊中金橙Ⅱ的檢測(cè)方法研究

2.1.1 薄層色譜法 取心可寧膠囊內(nèi)容物4 g，加80%丙酮溶液10 ml，密塞，振搖15 min，靜置，取上清液，作為供試品溶液。取紅花對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取金橙Ⅱ?qū)φ掌?，加乙醇制成? ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，精密吸取上述溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。供試品色譜中，金橙Ⅱ陽(yáng)性樣品在與金橙Ⅱ?qū)φ掌飞V相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)。金橙Ⅱ陰性樣品在與金橙Ⅱ?qū)φ掌飞V相應(yīng)的位置上未顯相同顏色的斑點(diǎn)，薄層色譜圖見(jiàn)圖1。心可寧膠囊樣品薄層檢查結(jié)果圖譜見(jiàn)圖2。

1.陰性 2.陽(yáng)性 3.金橙Ⅱ 4.紅花

1.樣D 2.樣B 3.樣A 4．金橙Ⅱ 5．樣C 6．樣E 7．樣F

2.1.2 高效液相色譜法

2.1.2.1 色譜條件 色譜柱：Alltech C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動(dòng)相：乙腈-0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液(含0.2%三乙胺，并用磷酸調(diào)pH值為3.0)(40∶60)；流量：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：484 nm；柱溫：28 ℃；進(jìn)樣體積：10 μl。

2.1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取金橙Ⅱ?qū)φ赵噭┻m量，加70%乙醇制成每1 ml約含60 μg的溶液，即得。

2.1.2.3 供試品溶液的制備 取心可寧膠囊內(nèi)容物約4 g，精密稱定，加入70%乙醇20 ml，超聲處理20 min，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.4 線性關(guān)系考查 取金橙Ⅱ?qū)φ掌啡芤?，分別精密吸取對(duì)照溶液1、2、3、4和5 ml至10 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。取上述溶液按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為A=33 983C-679.7(r=0.999 9)，結(jié)果顯示金橙Ⅱ濃度在6.75～33.75 μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.2.5 檢測(cè)限試驗(yàn) 取濃度為6.75 μg/ml的金橙Ⅱ?qū)φ掌啡芤?，分別加70%乙醇稀釋成0.081、0.135、0.270和0.675 μg/ml的溶液，取上述溶液各10 μl，進(jìn)樣，記錄峰面積，以信噪比為3計(jì)，測(cè)得金橙Ⅱ的最小檢測(cè)量為0.81 ng。

2.1.2.6 精密度試驗(yàn) 取同一濃度的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，其相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，分別記錄峰面積， RSD為0.5%，表明儀器精密度良好。

2.1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取心可寧膠囊樣品(樣B)，按樣品溶液的制備方法平行制備6份，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別記錄峰面積，并計(jì)算其含量，結(jié)果金橙Ⅱ平均含量為0.209 9 mg/g，RSD為0.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的心可寧膠囊樣品(樣B)約2 g，共6份，精密稱定，精密加入含金橙Ⅱ 0.023 88 mg/ml的對(duì)照品溶液20 ml，按樣品溶液制備方法制備供試液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為97.52%，RSD為1.3%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。見(jiàn)表1。

2.1.2.9 耐用性試驗(yàn) 分別考查了柱溫、流動(dòng)相比例及試驗(yàn)儀器三個(gè)影響因子，首先考查柱溫分別為25、28和30 ℃時(shí)的金橙Ⅱ檢查結(jié)果；另外考查流動(dòng)相乙腈-0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液(含0.2%三乙胺，并用磷酸調(diào)pH值為3.0)比例分別為(40∶60)、(35∶65)、(30∶70)時(shí)的金橙Ⅱ檢查結(jié)果；最后考查改變?cè)囼?yàn)儀器WATERS E 2695為Agilent 1200液相色譜儀時(shí)的金橙Ⅱ檢查結(jié)果，多種改變均未對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，證明本方法耐用性良好。

2.1.2.10 專屬性試驗(yàn) 取心可寧膠囊樣F(金橙Ⅱ陰性樣品)，按“2.1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果陰性樣品HPLC色譜圖中在與金橙Ⅱ?qū)φ掌废嗤Ａ魰r(shí)間位置上未出現(xiàn)色譜峰，而心可寧膠囊樣A(金橙Ⅱ陽(yáng)性樣品)HPLC色譜圖中在與金橙Ⅱ?qū)φ掌废嗤Ａ魰r(shí)間位置上出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，表明心可寧膠囊中其他藥味及輔料等對(duì)本方法測(cè)定無(wú)干擾。

2.1.2.11 測(cè)定法 吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μl，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果供試品色譜中，在與金橙Ⅱ?qū)φ赵噭┥V相應(yīng)的位置上，出現(xiàn)相同的色譜峰，見(jiàn)圖3。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

序號(hào)生產(chǎn)廠家測(cè)定結(jié)果樣AA檢出金橙Ⅱ樣BB檢出金橙Ⅱ樣CC檢出金橙Ⅱ樣DD檢出金橙Ⅱ樣EE檢出金橙Ⅱ樣FF未檢出金橙Ⅱ

2.1.2.12 HPLC-DAD驗(yàn)證 按HPLC法試驗(yàn)，以DAD檢測(cè)器進(jìn)行驗(yàn)證，供試品色譜中，與金橙Ⅱ?qū)φ赵噭┥V相同保留時(shí)間的色譜峰的DAD光譜圖與金橙Ⅱ?qū)φ赵噭┕庾V的譜形、最大吸收波長(zhǎng)均一致，心可寧膠囊陽(yáng)性樣A～樣E的DAD光譜見(jiàn)圖4。

2.1.3 質(zhì)譜法驗(yàn)證 采用乙腈-0.05 mol/L的醋酸銨溶液(含0.2%醋酸)(35∶65)為流動(dòng)相；其余色譜條件同高效液相色譜方法。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)：離子源為ESI源；負(fù)離子模式檢測(cè)；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)及二級(jí)質(zhì)譜全掃描；掃描范圍100～1 000 mz。電噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度：650 ℃；GS1：30 psi；GS2：30 psi；CUR：30 psi。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)離子對(duì)：327.0/170.9、327.0/155.9。取心可寧膠囊樣A進(jìn)行測(cè)定。供試品與金橙Ⅱ?qū)φ赵噭┥V相應(yīng)的位置上，出現(xiàn)相同的選擇離子流色譜峰；且供試品與對(duì)照品對(duì)應(yīng)色譜峰的分子離子峰相同，質(zhì)量均為326.9，與金橙Ⅱ的分子離子質(zhì)量相符。

圖4 金橙Ⅱ?qū)φ掌?A)

2.2 心可寧膠囊中樟腦的檢測(cè)方法研究

2.2.1 色譜條件 HP-FFAP石英毛細(xì)管柱(30 m×0.530 mm×1.0 μm)，柱溫140 ℃，進(jìn)樣口180 ℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器220 ℃，分流比為3∶1，流速2 ml/min，載氣為氮?dú)猓M(jìn)樣量1 μl。理論板數(shù)按樟腦計(jì)不得小于5 000，樟腦對(duì)照品及心可寧膠囊各樣品在上述色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖5。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取樟腦對(duì)照品24.75 mg，置25 ml量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，即得。另取冰片對(duì)照品適量，加無(wú)水乙醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取心可寧膠囊樣品10粒，研細(xì)，取內(nèi)容物約0.8 g，精密稱定，至錐形瓶中，精密加無(wú)水乙醇10 ml，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考查 取樟腦對(duì)照品溶液，分別精密吸取適量，制成系列濃度的對(duì)照品溶液。取上述溶液按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為A=3.806 4C+2.037 6(r=1)，結(jié)果顯示樟腦濃度在3.2～980.1 μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 檢測(cè)限試驗(yàn) 取濃度為10.03 μg/ml的樟腦對(duì)照品溶液，分別加無(wú)水乙醇稀釋成0.100 3、0.160 5和0.200 6 μg/ml的溶液，取上述溶液各1 μl，進(jìn)樣，記錄峰面積，以信噪比為3計(jì)，測(cè)得樟腦的最小檢測(cè)量為0.1 ng。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取同一濃度的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，其相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，分別記錄峰面積， RSD為2.4%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一濃度的樣品溶液，分別在1、2、3、5 和8 h注入氣相色譜儀，記錄峰面積，結(jié)果樟腦峰面積RSD為3.0%(n=6)，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.樟腦

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取心可寧膠囊樣品(樣G)，按樣品溶液的制備方法平行制備6份，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別記錄峰面積，并計(jì)算其含量，結(jié)果樟腦平均含量為0.538 3 mg/g，RSD為1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的心可寧膠囊樣品(樣G)約0.4 g，共6份，精密稱定，精密加入含樟腦0.025 66 mg/ml的對(duì)照品溶液10 ml，按樣品溶液制備方法制備供試液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為101.33%，RSD為1.9%，見(jiàn)表3。

表3 心可寧膠囊樟腦回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.10 樣品測(cè)定 取心可寧膠囊樣品，分別按“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，各取1 μl注入氣相色譜儀，依法測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算結(jié)果。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 心可寧膠囊樟腦測(cè)定結(jié)果

3 討論

試驗(yàn)中考查了氯仿-甲醇-冰乙酸(7∶ 1∶2)以及乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)兩個(gè)展開(kāi)系統(tǒng)，結(jié)果兩個(gè)展開(kāi)系統(tǒng)中金橙Ⅱ均能很好分離，但是第二個(gè)展開(kāi)系統(tǒng)同時(shí)能較好分離紅花藥材，能夠同時(shí)檢測(cè)樣品中紅花以及金橙Ⅱ的存在情況，故選擇第二個(gè)展開(kāi)系統(tǒng)。

金橙Ⅱ(orange Ⅱ)又名酸性橙Ⅱ、橙黃Ⅱ、酸性艷橙、金黃粉、β-萘酚偶氮對(duì)苯磺酸鈉，是食品禁用色素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)母核與蘇丹紅相同，為可疑致癌物質(zhì)，且有腎臟毒性。近年常發(fā)現(xiàn)將其非法添加于紅花藥材中以達(dá)到著色目的[2]。從心可寧膠囊的處方及生產(chǎn)工藝可知，方中含有原粉入藥的紅花藥材。在研究心可寧膠囊紅花薄層鑒別時(shí)，發(fā)現(xiàn)有的廠家樣品在Rf值較高于紅色素點(diǎn)的位置上出現(xiàn)一個(gè)橙黃色斑點(diǎn)，經(jīng)過(guò)研究證實(shí)為金橙Ⅱ的斑點(diǎn)，來(lái)源考慮為紅花藥材中非法添加的物質(zhì)。

《中國(guó)藥典》2010版一部在冰片項(xiàng)下增加了樟腦檢查項(xiàng)，限度為0.50%[3]。心可寧膠囊中檢出的樟腦，有的為廠家使用樟腦原料代替冰片非法投料，有的來(lái)源于劣質(zhì)冰片原料中的超量樟腦雜質(zhì)。

由上可知，金橙Ⅱ及樟腦均為心可寧膠囊中非法添加的非處方成分物質(zhì)。為有效地控制藥品質(zhì)量，嚴(yán)格打擊制假售劣，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)心可寧膠囊中金橙Ⅱ及樟腦的檢測(cè)。本方法專屬性高，靈敏度好，可以滿足心可寧膠囊中金橙Ⅱ的檢測(cè)及樟腦限量的檢查。

1 閔春艷,付凌燕，汪祺，等.紅花藥材摻偽染色檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥事，2011，25(8)：772-775

2 饒偉文，蔣玲，趙純玉，等.幾種染色摻假中藥的化工染料鑒定[J].藥物分析雜志，2007，27(11)：1742-1745

3 中國(guó)藥典[S].一部.2010：904

Study on determination of illegal additives orange Ⅱ and camphor in Xinkening capsules

Tian Jing，Li Qi，Wen Liyu

(Yangzhou Institute for Drug Control，Yangzhou 225009)

Objective: To establish methods for the determination of illegal additives orange Ⅱ and camphor in Xinkening capsules．Method: The TLC、HPLC and LC-MS/MS methods have been used to determine orangeⅡ and The GC methods have been used to determine camphor in Xinkening capsules．Results: Orange Ⅱ has a good linear relationship(r=0.999 9) at a range of 6.75～33.75 μg/ml．The average recovery was 97.5% and RSD was 1.3%(n=6)．Camphor showed a good linear relationship(r=1) at a range of 3.2～980.1 μg/ml．The average recovery was 101.3% and RSD was 1.9%(n=6)．Conclustion :The methods are simple，accurate，sensitive and repeatable and can be used to determine illegal additives orange Ⅱ and camphor in Xinkening capsules．

Xinkening capsules,orange Ⅱ,camphor,TLC,HPLC,GC

2014-09-21

R927.11

A

1006-5687(2015)01-0001-04