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        HPLC法測(cè)定枇杷葉中一種橙花叔醇苷的含量

        2015-02-23 10:59:41張紅茹
        天津藥學(xué) 2015年3期

        張紅茹,孫 琳

        (1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193; 2.天津中新藥業(yè)研究中心,天津 300457)

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        HPLC法測(cè)定枇杷葉中一種橙花叔醇苷的含量

        張紅茹1,2,孫 琳2

        (1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193; 2.天津中新藥業(yè)研究中心,天津 300457)

        目的:建立HPLC法測(cè)定枇杷葉中倍半萜苷—橙花叔醇苷的含量。方法:采用HPLC法測(cè)定,色譜柱為Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(29∶71);體積流量1.0 ml/min;柱溫30 ℃;檢測(cè)波長210 nm。結(jié)果:倍半萜苷在0.009 629~2.006 μg/ml(r=0.999 6)范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,平均回收率為96.23%。結(jié)論:該方法操作簡(jiǎn)單,結(jié)果準(zhǔn)確,專屬性好,可用于枇杷葉的質(zhì)量控制。

        枇杷葉,倍半萜苷,橙花叔醇苷,含量測(cè)定,HPLC

        枇杷葉Eriobotryaefolium為薔薇科植物枇杷的干燥葉,具有清肺止咳,降逆止嘔的功效,用于治療肺熱咳嗽,氣逆喘急,胃熱嘔逆,煩熱口渴[1]。枇杷葉的化學(xué)成分主要有三萜酸類、倍半萜及其苷類、多酚類、黃酮類以及糖苷類,具有抗炎止咳、抗病毒、降血糖和抗腫瘤等藥理活性[2]。

        目前報(bào)道的枇杷葉含量測(cè)定成分以齊墩果酸、熊果酸等三萜酸類多見[3-5],也有苦杏仁苷、綠原酸、槲皮素和山奈酚等[6-8]?!吨袊幍洹分衅浜繙y(cè)定是以熊果酸和齊墩果酸的三萜酸類為質(zhì)控指標(biāo),但此成分在眾多植物如山楂、女貞子、白花蛇舌草中均有存在且含量較高[9],故其作為質(zhì)控指標(biāo)專屬性較低。本文旨在對(duì)枇杷葉中橙花叔醇-3-O-{α-1-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}進(jìn)行HPLC法測(cè)定及方法學(xué)考查,以建立該倍半萜苷橙花叔醇苷的含量測(cè)定方法,因其為枇杷葉的特征成分,在枇杷葉中比上述其他成分更具專屬性,可作為枇杷葉質(zhì)量控制指標(biāo)的有效補(bǔ)充,為質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀(Waters公司);AL204-IC型萬分之一天平(Mettler公司);HU10260B型超聲儀(天津恒奧科技有限公司)。

        1.2 試藥 枇杷葉藥材(批號(hào)Y-1211-0149,Y-1406-0113,140501,購自天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司藥材分公司);橙花叔醇-3-O-{α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}(實(shí)驗(yàn)室自制,純度≥98%,以下稱為橙花叔醇苷);乙腈(色譜純,天津康科德科技有限公司);水為純凈水(Millipore純水機(jī)制備)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動(dòng)相乙腈-水(29∶71);檢測(cè)波長210 nm;柱溫30 ℃;體積流量1.0 ml/min。

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取橙花叔醇苷對(duì)照品適量,加甲醇溶解,配制成0.1 mg/ml的對(duì)照品溶液。

        2.2.2 供試品溶液的制備 取枇杷葉粉末(批號(hào)Y-1211-0149,過三號(hào)篩)約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入水飽和的正丁醇25 ml,稱定重量,超聲處理30 min,放冷,再稱定重量,用水飽和正丁醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液10 ml,置蒸發(fā)皿中,蒸干,殘?jiān)蛹状歼m量使溶解,轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.3 系統(tǒng)適用性 分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μl,注入液相色譜儀,按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析,結(jié)果見圖1。

        1.橙花叔醇苷

        2.4 線性關(guān)系考查 分別精密吸取濃度為0.009 628 8、0.032 096、0.080 24、0.160 48、0.401 2、0.802 4和2.006 mg/ml的對(duì)照品溶液各10 μl,按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析,測(cè)定峰面積,記錄數(shù)據(jù)。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=3 700 000X+20 494(r=0.999 6),結(jié)果表明橙花叔醇苷在0.009 629~2.006 mg/ml濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

        2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μl,按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定其色譜峰的峰面積,計(jì)算RSD為0.52%,說明儀器精密度良好。

        2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同批枇杷葉樣品,按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別在0、3、6、9、12、15、18 h進(jìn)樣10 μl,測(cè)定其色譜峰的峰面積,計(jì)算RSD為1.10%,說明供試品溶液在0~18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批枇杷葉樣品6份,按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.56%,說明該方法的重復(fù)性良好。

        2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品0.25 g,加入一定量的對(duì)照品,按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果平均回收率為96.23%,RSD為1.20%,結(jié)果見表1。

        表1 橙花叔醇苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

        2.9 樣品測(cè)定 取3批枇杷葉,精密稱定,按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定橙花叔醇苷的含量,測(cè)定結(jié)果見表2。

        表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=2)

        3 討論

        3.1 檢測(cè)波長的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行200~400 nm全譜測(cè)定,結(jié)果橙花叔醇苷在紫外光譜中只具末端吸收,為減少溶劑及雜質(zhì)干擾,故選擇210 nm作為檢測(cè)波長。

        3.2 流動(dòng)相的選擇 由于甲醇、甲酸和乙酸等溶劑在210 nm附近均有紫外吸收,對(duì)本成分的測(cè)定會(huì)有干擾,故選擇乙腈水作為流動(dòng)相,通過流動(dòng)相比例及不同色譜柱的考查,最終確定了基線平穩(wěn),峰形較好,保留時(shí)間適中的流動(dòng)相系統(tǒng)。

        3.3 提取溶劑和方法的選擇 在實(shí)驗(yàn)過程中考查了分別以100%、70%、50%甲醇及水飽和正丁醇超聲提取,結(jié)果表明70%、50%甲醇及水飽和正丁醇提取率相當(dāng),但70%、50%甲醇提取雜質(zhì)較多,故選擇水飽和正丁醇作為提取溶劑。又考查了以水飽和正丁醇為溶劑超聲和加熱回流的提取情況,結(jié)果表明超聲提取30 min即可提取完全。

        枇杷葉中倍半萜苷—橙花叔醇-3-O-{α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}是由意大利學(xué)者De Tommasi等[10]從枇杷葉中首次分離得到,并證實(shí)其有降低血糖的作用[11]。其苷元橙花叔醇也是枇杷葉中揮發(fā)油的主要成分[12],具有抗菌作用[13],與枇杷葉已知療效相關(guān),橙花叔醇苷有可能在體內(nèi)代謝為橙花叔醇,間接發(fā)揮療效,但還需進(jìn)一步證實(shí)。目前枇杷葉含量測(cè)定的指標(biāo)成分多為三萜酸類,但中藥常用水提或水煎煮后服用,使用脂溶性很強(qiáng)的熊果酸等三萜酸類顯然不太合理,本文建立水溶性的橙花叔醇苷含量測(cè)定的方法,以橙花叔醇苷作為枇杷葉的質(zhì)控指標(biāo),可以更合理的控制其質(zhì)量。

        1 中國藥典[S]. 一部.2010:190-191

        2 陸林博. 枇杷葉的化學(xué)成分研究[D]. 南京師范大學(xué),2006:10-12

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        4 蔡雪萍,李振華,華俊磊,等. 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定枇杷葉有效部位中6種三萜酸成分的量[J]. 中草藥,2013,44(21):3057-3062

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        11 De Tommasi N,De Simone F,Cirino G,etal. Hypoglycemic effects of sesquiterpene glycosides and polyhydroxylated triterpenoids of Eriobotrya Japonica[J].Planta Med,1991,57(5):414

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        Determination of nerolidol glycosides inEriobotryaefoliumby HPLC

        Zhanghongru1,2,Sunlin2

        (1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193;2.Tianjin Zhongxin Pharmaceuticals R&D Center,Tianjin 300457)

        Objective: To establish an HPLC method for determination of a sesquiterpene glycosides-nerolidol glycosides inEriobotryaefolium.Methods: HPLC was applied with the chromatographic condition as follows:The chromatographic column was Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)at 30 ℃;acetonitrile-water(29∶71) as the mobile phase;flow rate was 1.0 ml/min and the detection wavelength was 210 nm.Results: Linear relationships was 0.009 629~2.006 μg(r=0.999 6),the average recovery was 96.23%.Conclusion: The method is convenient,accurate and specific,can be applied to the quality control ofEriobotryaefolium.

        Eriobotryaefolium,sesquiterpene glycosides,nerolidol glycosides,quantitative determination,HPLC

        2015-03-17

        R927.2

        A

        1006-5687(2015)03-0009-03

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