陳　琳，　郝長春*，　梁　濤，　南　征，　孫潤廣

(1　陜西師范大學　物理學與信息技術學院；

2　食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西　西安　710119)

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化學修飾杏鮑菇多糖對K562細胞的抑制作用

陳琳1，郝長春1*，梁濤2，南征1，孫潤廣1

(1陜西師范大學物理學與信息技術學院；

2食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710119)

摘要：對堿提杏鮑菇粗多糖進行了硫酸化、磷酸化、乙?；揎棧ζ潴w外抗腫瘤活性進行了研究。利用紅外光譜技術對化學修飾前后的堿提杏鮑菇粗多糖(PEAP)結構進行檢測，并采用MTT法研究未修飾多糖與修飾后多糖對人白血病細胞K562體外增殖抑制作用。結果顯示:化學修飾后的PEAP分別具有硫酸基團、磷酸基團、乙酰基團的特征吸收峰。化學修飾后的PEAP均對白血病細胞K562的抑制作用有一定提高，其中乙?；吁U菇粗多糖(Ac-PEAP)對白血病細胞K562的抑制作用最強。

關鍵詞:杏鮑菇；多糖；化學修飾；抗腫瘤活性

腫瘤是當今世界直接危及人類生命的一種最常見、最嚴重的疾病，如何有效地預防和治療腫瘤已成為醫(yī)學和藥學領域研究的一個熱點[1]。研究表明，部分真菌多糖一方面能夠有效提高機體免疫力，同時對癌變細胞還表現(xiàn)出顯著抑制作用[2]，優(yōu)選具一定抗癌作用的天然多糖，并了解該類多糖的抗癌機理已成為現(xiàn)在腫瘤研究的熱門問題。因此，多糖有望成為協(xié)同抗癌藥物，緩解甚至治療腫瘤的有效來源。

多糖(Polysaccharide)是由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接形成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物，廣泛存在于動物、植物、微生物中[3]。大量研究證實部分真菌類多糖不但具有能夠抑制腫瘤細胞生長的特點，同時其相對機體毒性較低[4-5]。多糖的生物活性直接或間接受分子結構的影響，因此對多糖的分子結構進行修飾可以增強多糖的活性[6]，降低其毒副作用[7-11]。

杏鮑菇又名刺芹側耳，屬于真菌門，側耳屬植物，營養(yǎng)豐富，風味獨特，并且具有多糖、酚類、海藻糖等多種活性成分，已成為一種食療一體的兩用食用菌新品種。杏鮑菇具有抗氧化[12]、抗病毒[13-14]、抗腫瘤[14-15]、降血脂[16]及潤腸胃[17]等多種功效，其中杏鮑菇多糖成分的結構和生物活性等諸多方面都受到了研究者的關注。

本文對三種化學修飾的杏鮑菇多糖體外抑制K562細胞增殖的活性進行了研究，為杏鮑菇多糖的生物活性研究及開發(fā)抗腫瘤藥物市場提供理論依據。

1材料與方法

1.1　材料與試劑

杏鮑菇粗多糖(PEAP)由陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院提供；K562細胞由陜西師范大學生命科學學院提供。

胎牛血清購于杭州四季青生物有限公司；DMSO購于美國Sigma公司；MTT購于美國Amresco公司；RPMIMedium1640培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2　儀器與設備

DG5032型酶聯(lián)免疫檢測儀(南京華東電子集團意料設備有限公司)；XDS-2B倒置生物顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；Avatar360E.S.P.FTIR傅里葉變換紅外光譜儀(尼高力)；HH·CP-01W型細胞培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；H-H-4型恒溫水浴鍋(上海浦東物理光學儀器公司)；SZ-97自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器有限公司)。

1.3　實驗方法

1.3.1堿提杏鮑菇粗多糖的化學修飾硫酸酯化堿提杏鮑菇粗多糖(S-PEAP)的制備：量筒量取無水吡啶10mL加入到三頸瓶中，并持續(xù)攪拌裝置及其冷凝管，待到三頸瓶中量取的無水吡啶經過冰水浴使其充分冷卻后，此時快速攪拌，并用滴液漏斗緩緩加入4mL氯磺酸，滴加完畢后繼續(xù)攪拌30min。量取7mL二甲基甲酰胺用來溶解酯化試劑，再加入堿提杏鮑菇粗多糖樣品100mg，80℃攪拌，待反應3h后，用氫氧化鈉來中和反應液，此時離心，移取上清液分別用自來水和蒸餾水各透析2d，并收集透析液濃縮，醇淀12h后，再離心，稱取沉淀溶于定量蒸餾水中，之后分別用自來水和蒸餾水透析2d，離心后取上清液，經冷凍干燥即得硫酸酯化堿提杏鮑菇粗多糖樣品(S-PEAP)[18]。

磷酸酯化堿提杏鮑菇粗多糖(P-PEAP)的制備[19]：精確稱取堿提杏鮑菇粗多糖100mg溶解于100mL蒸餾水中，并在室溫下調節(jié)pH=8.0，之后分別加入三氯氧磷(POCl3)，在60℃恒溫水浴鍋中使其反應40min。當反應結束后，冷卻至室溫并調節(jié)pH=6.5，后用無水乙醇沉淀，離心，再醇沉，經冷凍干燥即得磷酸酯化堿提杏鮑菇粗多糖樣品(P-PEAP)。

乙?；瘔A提杏鮑菇粗多糖(Ac-PEAP)的制備[20]：精確稱取堿提杏鮑菇粗多糖100mg溶解于10mL蒸餾水中，并用0.5mmol/LNaOH調節(jié)到pH=9，之后30℃保溫反應4h。在此期間分為6次加入乙酸酐，每次加入量為2.5mL，同時不斷逐滴加入0.5mol/LNaOH以保持pH=8.0。待反應結束后，用5mol/LHCL調節(jié)pH=7.0，混合溶液經透析，濃縮，冷凍干燥后即得乙?；瘔A提杏鮑菇粗多糖樣品(Ac-PEAP)。

1.3.2修飾前后多糖的紅外光譜(IR)分析稱取適量杏鮑菇多糖與干燥后的溴化鉀粉末混合研磨，待至細末狀，稱取適量杏鮑菇多糖和溴化鉀混合物壓片，進行IR掃描，掃描范圍從4000至400cm-1，以溴化鉀壓片為掃描背景[21]。

1.3.3白血病細胞K562的培養(yǎng)人白血病細胞K562經復蘇后，常規(guī)培養(yǎng)于滅菌后的RPMI1640培養(yǎng)基中(含10%的胎牛血清和青霉素、鏈霉素各100IU/mL)，置于溫度37℃、二氧化碳濃度為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[22]。

1.3.4MTT法檢測細胞增殖實驗[23-24]取對數生長期白血病細胞K562，經臺盼藍染色后計數并以1×105的密度接種于96孔板中，設置6個重復孔，每孔加入100μL細胞懸液。待培養(yǎng)24h后，調零組及其對照組每孔加入100μL滅菌后RPMI1640培養(yǎng)基溶液,而處理組分別加入體積為100μL不同濃度的杏鮑菇粗多糖溶液，設置多糖溶液的濃度梯度為25、50、100、200、400和800μg/mL。多糖溶液與細胞接觸24、48、72h后，每孔中加入20μLMTT(5mg/mL)溶液，置于培養(yǎng)箱孵育4h，1000r/min的條件下離心5min，移除上清液，每孔加入180μLDMSO溶液，輕微振蕩96孔板10min，使用酶標儀在492nm波長處測定每孔吸光度。重復實驗3次，計算細胞抑制率：

細胞相對生長抑制率=

1.4　數據處理

利用OriginPro8.5作圖，SPSS軟件進行數據分析。

2結果與分析

2.1　紅外結果分析

圖1　PEAP和S-PEAP的紅外光譜Fig.1　IR　spectrum　of　PEAP　and　S-PEAP

圖2　PEAP和P-PEAP的紅外光譜Fig.2　IR　spectrum　of　PEAP　and　P-PEAP

圖3　PEAP和Ac-PEAP的紅外光譜Fig.3　IR　spectrum　of　PEAP　and　Ac-PEAP

2.2　抗腫瘤實驗分析

PEAP對人白血病K562細胞作用24、48、72h后，結果顯示出一定的抑制作用。PEAP對細胞的抑制效果表現(xiàn)為72h最明顯，其次是48h，多糖作用于細胞24h呈現(xiàn)最弱抑制效果(P<0.05,P<0.01)。多糖濃度在0~400μg/mL范圍內，對K562細胞的生長呈現(xiàn)時間及計量依賴方式(P<0.05,P<0.01)；在400~800μg/mL范圍內，多糖對細胞生長抑制程度未保持原有變化趨勢，而是隨多糖濃度的增大而逐漸減小，結果如圖4所示。

圖4　PEAP對K562細胞的抑制效果Fig.4　Inhibition　effects　of　PEAP　against　K562　cells

S-PEAP在實驗作用時間內對白血病K562細胞的抑制作用較PEAP有所增強，抑制效果在48h達到最大，24h次之，72h抑制作用較弱。在S-PEAP濃度為200μg/mL時，對白血病K562細胞的抑制率最大，抑制率可達到33.82%；隨著多糖濃度的持續(xù)增加，抑制率開始有所下降，結果見圖5。研究表明正因為食用菌多糖的生物活性與其結構和理化性質有著密切聯(lián)系，所以多糖經硫酸化修飾后，引入的硫酸根基團改變了多糖支鏈的空間結構，在一定程度上提高了其水溶性與糖鏈的屈伸程度，這可能是引起生物活性改變的重要原因[28]。

圖5　S-PEAP對K562細胞的抑制效果Fig.5　Inhibition　effects　of　S-PEAP　against　K562　cells

P-PEAP對人白血病K562細胞的體外抑制作用較為顯著(如圖6所示)。多糖濃度在25~400μg/mL范圍內，多糖對細胞的抑制程度隨濃度的遞增而逐漸增大，當濃度為400μg/mL時，P-PEAP對人白血病K562細胞的抑制率達到最大，其中72h抑制率最大約為30.11%。在400~800μg/mL范圍內，細胞生長抑制程度隨著濃度增大反而逐漸減小，故P-PEAP多糖濃度為400μg/mL，作用時間為72h時，P-PEAP對白血病細胞K562顯示出最大的抑制率。研究表明化學基團的引入也可能會增強多糖的活性，使多糖產生新的活性，磷酸化修飾是將磷酸基團引入多糖的殘基上，但其具體的作用機制研究較少，有待得到進一步的研究。

圖6　P-PEAP對K562細胞的抑制效果Fig.6　Inhibition　effects　of　P-PEAP　against　K562　cells

Ac-PEAP對白血病K562細胞的體外抑制作用最為顯著。多糖溶液濃度在0~200μg/mL之間，Ac-PEAP對K562細胞的抑制活性與多糖濃度呈正相關，當濃度持續(xù)增大，Ac-PEAP對K562細胞的抑制作用逐漸減弱。Ac-PEAP對細胞的抑制作用在48h表現(xiàn)最為顯著，結果見圖7。魏文青等[29]的研究證明，腫瘤藥物通常存在一個最佳的作用時間，腫瘤細胞的生長處于該時間時，抑制作用最強，先于或超過這個最佳作用時間點，抑制作用效果并不理想。Ac-PEAP作用時間48h時，濃度在200μg/mL抑制作用最強，達到35.32%。研究表明對多糖進行化學修飾后，引入不同類型的基團，有助于提高多糖的生物學活性，乙?；囊肟梢愿淖兌嗵堑臋M次序和定向性，使活性基團暴露，最終影響多糖在水中的溶解性[30]。

圖7　Ac-PEAP對K562細胞的抑制效果Fig.7　Inhibition　effects　of　Ac-PEAP　against　K562　cells

3結論

多糖的生物活性與其結構和理化性質密切相關，杏鮑菇多糖經過化學修飾后，引入不同類型的基團后，原多糖結構發(fā)生變化，從而影響了多糖的抗腫瘤活性。本實驗通過對杏鮑菇粗多糖進行結構修飾后研究其體外抗腫瘤活性，PEAP對人白血病細胞K562具有一定的抑制效果，特別是經化學修飾后對白血病細胞的抑制作用增強，其中Ac-PEAP濃度為200μg/mL和作用時間為48h時的抗腫瘤活性最強；硫酸化修飾與磷酸化修飾多糖的抗癌活性與對多糖C—H伸縮振動的取代度有關，硫酸化修飾完全取代抗癌活性最高，磷酸化修飾部分取代，抗癌活性次之。

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〔責任編輯李博〕

第一作者：蘇玉波，男，碩士研究生，研究方向為資源環(huán)境遙感與GIS應用。E-mail:398444617@qq.com

StudiesoninhibitioneffectonK562cellsofchemical

modifiedpolysaccharideofPleurotuseryngii

CHENLin1，HAOChangchun1*，LIANGTao2，NANZheng1，SUNRunguang1

(1SchoolofPhysicsandInformationTechnology；

2SchoolofFoodEngineeringandNutritionalScience，ShaanxiNormalUniversity，

Xi′an710119，Shaanxi，China)

Abstract:ThepolysaccharideswereextractedfromPleurotuseryngiibyalkalisolution,thenweremodifiedbysulfation,phosphorylation,andacetylation.Thecorrespondingantitumoractivitieshavebeenstudied.ThestructureofmodifiedandunmodifiedPleurotuseryngiialkalipolysaccharide(PEAP)wastestedbytheinfraredspectroscopy.ThentheantitumorabilityweretestedbyMTTassayinvitro.Theresultsshowthatthecharacteristicabsorptionpeaksofsulfuricgroup,phosphategroupandacetylgroupwereobservedrespectively.Theabilityoftheanti-tumorHumanLeukemiaCellK562activityofthechemicalmodifiedPEAPwereallimprovedandtheacetylatedmodifiedPEAP(Ac-PEAP)hasthebestinhibitoryability.

Keywords:Pleurotuseryngii；polysaccharide；chemicalmodification；antitumoractivity

通信作者：*張福平，男，副教授。E-mail:zhangfuping@163.com

基金項目：陜西省“百人計劃”項目；國家科技支撐計劃(2012BAC08B07)；中國博士后科學基金資助項目(2011M501496)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目(GK201101002)

收稿日期：2014-07-15

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2015.02.421

文章編號：1672-4291(2015)02-0079-06

中圖分類號:R273

文獻標志碼:A