吳立君

（黑龍江職業(yè)學(xué)院第二校區(qū)，黑龍江哈爾濱 150111）

用ELISA方法檢測(cè)豬瘟病毒抗體水平的操作步驟及注意事項(xiàng)

吳立君

（黑龍江職業(yè)學(xué)院第二校區(qū)，黑龍江哈爾濱 150111）

當(dāng)前規(guī)?；i場(chǎng)對(duì)豬病的診斷越來(lái)越依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷數(shù)據(jù)，對(duì)基層畜牧獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)而言，運(yùn)用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）進(jìn)行檢測(cè)疾病的技術(shù)推廣勢(shì)在必行。本文以檢測(cè)豬瘟抗體水平為例，詳細(xì)講解實(shí)驗(yàn)操作流程及北方冬季操作的注意事項(xiàng)，旨在對(duì)豬場(chǎng)基層實(shí)驗(yàn)人員有指導(dǎo)意義。

當(dāng)前規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)越來(lái)越重視用實(shí)驗(yàn)室診斷數(shù)據(jù)來(lái)指導(dǎo)防疫工作，對(duì)此實(shí)驗(yàn)室人員及基層防疫人員的實(shí)驗(yàn)技術(shù)直接關(guān)系到豬場(chǎng)的防疫工作的部署，現(xiàn)階段來(lái)看，ELISA技術(shù)在基層尚屬難操作實(shí)驗(yàn)，本文就以檢測(cè)豬瘟病毒抗體水平為例，詳細(xì)講解實(shí)驗(yàn)步驟及北方操作實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)，希望對(duì)從事檢疫工作的基層實(shí)驗(yàn)人員有所幫助。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

檢測(cè)豬瘟血清或血漿中特異性抗體，為豬場(chǎng)防疫工作提供依據(jù)。

2 試劑、器材及設(shè)備

2.1 試劑愛(ài)德士（IDEXX）公司生產(chǎn)豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒（Classical Swine Fever Virus Antibody Test Kit）；去離子水。

2.2 器材單道和8道微量移液器（30～300μL），槍頭，量筒，燒杯，避光蓋板，計(jì)時(shí)器，加樣槽，EP管架，PE手套、一次性乳膠手套、口罩、帽子、鞋套、防護(hù)服，吸水紙。

2.3 設(shè)備自動(dòng)洗板機(jī)，酶標(biāo)儀，電腦，溫箱，空調(diào)等。

3 操作步驟

3.1 接收新的豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒時(shí)，檢查內(nèi)容物組分，保質(zhì)期，用標(biāo)記筆在盒子顯著地方標(biāo)記開啟時(shí)間、每個(gè)組分試劑的中文名稱以及每次使用酶標(biāo)板的數(shù)量。

3.2 操作前將試劑盒組分恢復(fù)室溫18～26℃2h。

3.3 待檢血清混勻，試劑盒內(nèi)組分試劑輕輕渦旋、旋轉(zhuǎn)混勻。

3.4 填寫實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范記錄表。例如：操作人：某某某，操作時(shí)間：2015-11-11，試劑盒種類：豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒。批號(hào)：D191，效期：2016-5-31。

3.5 EP管架上留出四孔，余下待檢的血清按照順序豎排擺放。剩余的酶標(biāo)板卸下，封閉放置與干燥劑一起放入原袋子中。按照血清順序，將豬血樣標(biāo)號(hào)豎排填寫到記錄中。

3.6 用一次性PE手套蓋住加樣槽，將適量的樣品稀釋液倒入加樣槽中。每個(gè)孔中用加入50μL樣品稀釋液。注意槍頭勿觸到酶標(biāo)板底部，加樣槽中余下的試劑切勿倒入瓶中。

3.7 開啟新槍頭盒，每孔加入血清50μL，緩慢吹打3～5次混勻，避免產(chǎn)生氣泡，每加入一孔更換一次槍頭，使之一一對(duì)應(yīng)。豎排加樣，順序?yàn)橄燃尤腙幮匝澹?孔，陽(yáng)性血清，2孔，待檢血清，若干孔。

3.8 用封口膜封閉酶標(biāo)板，避免液體蒸發(fā)，蓋上避光板，在室溫18～26℃孵育2h。（也可采用過(guò)夜孵育模式，4℃孵育12～18h）。

3.9 孵育期間，配制1倍洗滌液。計(jì)算出本次檢測(cè)所需洗滌液用量。例如所需總體積200mL，取10倍濃縮液20mL加入180mL超純水，混勻，備用。

3.10 孵育完畢后，打開避光板，揭開封口膜，握住酶標(biāo)板框，避免觸到酶標(biāo)板底部，垂直將液體倒入廢液桶中。采用時(shí)手動(dòng)洗板，將配置好的洗滌液倒入加樣槽中，用多道移液器吸入300？l洗滌液加入每個(gè)反應(yīng)孔中，輕輕晃動(dòng)混勻后，手握酶標(biāo)板框，垂直棄掉洗液，反復(fù)3次。最后一次棄掉洗液后，用吸水紙上大力扣板，將剩余液體棄掉。在加入酶標(biāo)抗體之前，避免孔干燥。

3.11 每孔中加入100μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗豬瘟病毒的酶標(biāo)抗體，輕輕晃動(dòng)混勻，用封口膜蓋上，扣上黑色避光板，室溫孵育30min。

3.12 重復(fù)步驟10。孵育完畢后，打開避光板，揭開封口膜，握住酶標(biāo)板框，避免觸及酶標(biāo)板底部，垂直將液體倒入廢液桶中。將配置好的洗滌液倒入加樣槽中，用多道移液器吸入300？l洗滌液加入每個(gè)反應(yīng)孔中，輕輕晃動(dòng)混勻后，手握酶標(biāo)板框，垂直棄掉洗液，反復(fù)3次。最后一次棄掉洗液后，用吸水紙上大力扣板，將剩余液體棄掉。

3.13 將底物倒入加樣槽，每孔加入100μL底物，蓋上黑色避光板，將酶標(biāo)板避光放置10min。

3.14 提前開啟酶標(biāo)儀預(yù)熱，設(shè)置參數(shù)。

3.15 按照加入底物的順序，每孔加入終止液100μL，終止反應(yīng)。

3.16 盡快將反應(yīng)板放入酶標(biāo)儀中，讀取數(shù)值并命名保存。

3.17 血樣及試劑盒及時(shí)放回保存地點(diǎn)。

4 注意事項(xiàng)

4.1 將所有樣品試劑視為潛在的生物污染物，操作者帶好手套、口罩、帽子及防護(hù)服。

4.2 嚴(yán)格控制孵育時(shí)間，不可擅自增加或減少。

4.3 及時(shí)更換槍頭，避免血樣之間交叉污染，避免試劑交叉污染。

4.4多余的試劑切勿倒回瓶?jī)?nèi)。

4.5 不同批次試劑不可混用。

5 討論

判定結(jié)果的數(shù)值均在毫厘之間，細(xì)節(jié)上的規(guī)范往往是成功與否的關(guān)鍵。進(jìn)入秋冬季節(jié)，我省北方的部分實(shí)驗(yàn)室溫度均低于22℃，操作結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性的情況，及時(shí)改善室內(nèi)溫度，打開空調(diào)，取暖器等，確保結(jié)果準(zhǔn)確。

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．12.014