臧 矯綜述，邢 華審校

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

帕金森病實(shí)驗(yàn)研究中多巴胺及其合成酶測(cè)定方法的研究進(jìn)展

臧 矯綜述，邢 華審校

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

帕金森??； 黒質(zhì)； 多巴胺； 神經(jīng)元； 多巴胺合成酶； 測(cè)定方法； 綜述

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是一種以運(yùn)動(dòng)癥狀如靜止性震顫、肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)不穩(wěn)為主要臨床表現(xiàn)進(jìn)行歸類(lèi)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，多發(fā)于中老年人。其主要病理表現(xiàn)是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性而造成其靶結(jié)構(gòu)紋狀體的多巴胺（dopamine，DA）含量下降。在世界范圍內(nèi)，1%～2%的65歲以上老年人患有PD，80歲以上患病率增加到4%[1]。美國(guó)羅切斯特大學(xué) Dorsey等推算，PD人數(shù)在2030年會(huì)翻一番，達(dá)930萬(wàn)人。根據(jù)WHO報(bào)道，全球400萬(wàn)例患者中有170萬(wàn)例在中國(guó)，PD已成中老年人的“第三殺手”[2]。DA作為下丘腦和腦垂體腺中的一種關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)，選擇性作用于抑制性神經(jīng)元，如若DA合成不足，興奮性膽堿能神經(jīng)元處于相對(duì)優(yōu)勢(shì)，則引發(fā)PD[3]。而在目前PD的治療方案中，不論是藥物治療、手術(shù)治療、細(xì)胞移植治療或是基因移植治療，普遍以恢復(fù)腦內(nèi)DA水平來(lái)達(dá)到控制病情的效果。因此，DA含量及其合成相關(guān)影響因素在PD研究中起到重要作用。本文主要針對(duì)近年來(lái)對(duì)腦內(nèi)DA含量及影響DA合成酶測(cè)定方法的相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述，為后續(xù)研究工作的開(kāi)展提供參考和借鑒。

2 PD腦內(nèi)DA的變化

PD是一種緩慢發(fā)生的選擇性中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元喪失和紋狀體DA含量顯著減少的老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[4]。DA拮抗劑和激動(dòng)劑的應(yīng)用研究表明，DA受體在運(yùn)動(dòng)控制中起到重要作用。通常情況下，激動(dòng)劑可提高DA的運(yùn)動(dòng)功能，而拮抗劑的作用則相反。PD就是由于DA能神經(jīng)元變性引起黑質(zhì)-紋狀體通路內(nèi)DA顯著減少所致[5]。

2.1 PD相關(guān)基因與DA 1997年，祖籍希臘、生活在美洲的家族，被確診為是α-synuclein蛋白基因突變患者，其殼核和尾狀核的18F DA攝入明顯減少，提示黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的DA神經(jīng)元喪失與α-synuclein蛋白基因突變有關(guān)。同年，經(jīng)連鎖分析后，科學(xué)家們將另一基因定位在第6號(hào)染色體上，不久后該基因被克隆，命名為“Parkin”基因。該基因的生物活性尚不清楚，只發(fā)現(xiàn)在功能上與泛素相近。后有研究報(bào)道，Parkin蛋白廣泛存在于腦組織中，尤其集中分布在中腦黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)，在攜帶該基因突變的患者大腦中，普遍存在Parkin蛋白的嚴(yán)重缺失現(xiàn)象。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，Parkin基因的外顯子缺失和點(diǎn)突變可能會(huì)干擾泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路，其結(jié)果導(dǎo)致中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的變性死亡，進(jìn)而影響DA的生成，但確切致病機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[6]。隨著研究的深入，除α-synuclein蛋白基因與Parkin基因以外，還有5種基因也逐漸被確定與PD有關(guān)，分別是NCHL1基因、NURRR1基因、DJ-1基因、PINK1基因和LRRK2基因。

2.2 PD病理生理與DA PD以黑質(zhì)紋狀體DA神經(jīng)元進(jìn)行性喪失及DA缺少為特征。近年來(lái)，在錐體外系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元相互作用的許多其他神經(jīng)元也被發(fā)現(xiàn)參與PD的病理生理過(guò)程。其病理變化主要位于腦黑質(zhì)部位，肉眼可見(jiàn)黑質(zhì)體積縮小，色素消失，鏡檢黑色素及神經(jīng)細(xì)胞減少達(dá)59%，伴反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)減少，從偏側(cè)PD綜合征者癥狀可見(jiàn)，患者對(duì)側(cè)紋狀體DA明顯減少。因此，紋狀體DA含量減少被認(rèn)為是PD最重要也最為恒定的生化變化，且根據(jù)臨床數(shù)據(jù)顯示，DA含量減少超過(guò)70%即出現(xiàn)PD癥狀[7]。

2.3 PD與多巴胺能神經(jīng)元免疫因素 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，早在1978年，陳遠(yuǎn)賓等[8]就提出免疫學(xué)異常可能參與PD的發(fā)病。在PD患者腦脊液中發(fā)現(xiàn)，抗多巴胺能神經(jīng)元抗體，PD患者的血漿和腦脊液能抑制培養(yǎng)多巴胺能神經(jīng)元的生長(zhǎng)功能。Yuan等[9]研究表明，PD患者血清免疫球蛋白（IgG）可引起黑質(zhì)的相對(duì)特異性損傷，實(shí)驗(yàn)從5例PD患者和10份對(duì)照血清純化得到IgG后，注入成齡大鼠右側(cè)黑質(zhì)內(nèi)，4周后發(fā)現(xiàn)PD IgG組注射側(cè)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)側(cè)下降50%，而對(duì)照組下降18%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Beal等[10]的研究是把經(jīng)DA自身氧化產(chǎn)物醌修飾后的卵清蛋白分別與PD血清和對(duì)照組血清反應(yīng)，其陽(yáng)性率結(jié)果顯示，PD組為7%（n=21），對(duì)照組為0（n=21）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，PD患者血清中存在醌修飾卵清蛋白的抗體，并且可能參與或加重PD的炎性反應(yīng)。

3 DA及其檢測(cè)方法

DA作為下丘腦和腦垂體腺中的一種關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)，參與興奮及愉悅的信息傳遞，也與上癮相關(guān)，因此又被稱(chēng)為“大腦獎(jiǎng)賞因子”或“愛(ài)情分子”。

3.1 DA發(fā)現(xiàn)歷程 DA在過(guò)去被懷疑具有生化作用，是合成去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）的中間產(chǎn)物，直到1957年有學(xué)者才提出，其除了作為NE生物合成的前體外，還有不相關(guān)獨(dú)立的外周生理作用。

1958年首先報(bào)道紋狀體內(nèi) DA占全腦含量的70%，且與NE分布不同，并提出DA可能是獨(dú)立的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)。20世紀(jì)60年代，PD被發(fā)現(xiàn)是黑質(zhì)致密區(qū)DA能神經(jīng)元的變性所致，臨床上用左旋多巴（L-dopa）治療取得好的療效。通過(guò)大量研究，DA被確定為中樞神經(jīng)遞質(zhì)[13]。

3.2 DA合成過(guò)程 中腦合成的DA是由酪氨酸（tyrosine，Tyr/Y）先通過(guò)TH轉(zhuǎn)化生成左旋多巴，再經(jīng)芳香族氨基酸脫羧酶（aromaticL-aminoaciddecarboxylase，AADC）的作用，左旋多巴脫羧生成DA。TH在整個(gè)過(guò)程中充當(dāng)限速酶，四氫蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）是第一步酶促反應(yīng)的輔酶。BH4由GTP生成，GTP環(huán)化水解酶-Ⅰ（GTP cyclohydrolaseⅠ，GCH-Ⅰ）又是BH4的第一步酶促反應(yīng)的限速酶[14]。

3.3 生物樣品中DA的檢測(cè)方法 DA的化學(xué)名稱(chēng)為4-（2-乙胺基）-1，2-苯二酚。生物樣品中DA的含量測(cè)定方法主要有以下幾種：分光光度法、熒光法、高效液相色譜（HPLC）法、電位溶出法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法。其中，HPLC又根據(jù)檢測(cè)方法不同，可細(xì)分為：HPLC-質(zhì)譜連用法、HPLC-電化學(xué)法、RP-HPLC-紫外檢測(cè)法、RP-HPLC-熒光檢測(cè)法等。

3.3.1 分光光度法 分光光度計(jì)采用可產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過(guò)系列分光裝置產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光線(xiàn)透過(guò)測(cè)試樣品，部分光線(xiàn)被吸收，獲得樣品的吸光值（OD值），進(jìn)而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。該方法靈敏度高、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、快速、應(yīng)用廣泛。但因其準(zhǔn)確度相對(duì)不高，靈敏度達(dá)不到研究要求，所以在近年來(lái)的研究性實(shí)驗(yàn)中少有采用。

3.3.2 熒光光度測(cè)定 熒光光度測(cè)定的原理是DA與Tb3+在pH 6.5～6.8條件下能形成較強(qiáng)的熒光絡(luò)合物，其激發(fā)峰在300 nm，發(fā)射峰在494 nm和545 nm處。利用生成的熒光絡(luò)合物吸收特征波長(zhǎng)的光后發(fā)射熒光，通過(guò)測(cè)定其熒光強(qiáng)弱來(lái)進(jìn)行定量分析。該方法靈敏度高（比分光光度法高1～3個(gè)數(shù)量級(jí)），選擇性高，線(xiàn)性范圍廣，且測(cè)定結(jié)果與斑點(diǎn)形狀無(wú)關(guān)[15]。

3.3.3 HPLC HPLC又分為紫外檢測(cè)法、電化學(xué)法和熒光檢測(cè)法等。

3.3.3.1 紫外檢測(cè)法 DA具紫外吸收，化學(xué)結(jié)構(gòu)中有2個(gè)鄰位酚羥基，可采用反相HPLC測(cè)定，其紫外吸收波長(zhǎng)λmax為280 nm。HPLC-紫外檢測(cè)方法測(cè)定操作簡(jiǎn)便、靈敏度良好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。普通實(shí)驗(yàn)室一般配備紫外檢測(cè)器，但因電化學(xué)檢測(cè)器價(jià)格昂貴，較少配備，對(duì)生物樣品中DA的測(cè)試難以開(kāi)展。因此，紫外檢測(cè)法適用于普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行腦組織DA的分析檢測(cè)[16]。

刁娟娟等[17]在用HPLC-紫外檢測(cè)DA含量時(shí)，測(cè)得正常小鼠腦紋狀體內(nèi)DA含量為（13.6±3.6）μg/g（n=8）。實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，DA供試品在室溫下不穩(wěn)定，4℃僅可保存24 h。提示在檢測(cè)DA含量的實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，樣品也應(yīng)在提取后的當(dāng)天（24 h內(nèi)）檢測(cè)完畢，不宜長(zhǎng)時(shí)間保存后再進(jìn)樣。

3.3.3.2 電化學(xué)法 DA結(jié)構(gòu)中2個(gè)鄰位酚羥基苯環(huán)上電子密度高，極易氧化成鄰醌，具有電活性，可被檢測(cè)。電化學(xué)法選擇性非常高，只有容易被氧化還原具有電活性的物質(zhì)，才能被檢測(cè)出。缺點(diǎn)是對(duì)設(shè)備要求較高[18-19]。

魏麗麗等[20]在用HPLC-電化學(xué)法檢測(cè)時(shí)結(jié)合微透析技術(shù)，從生物活體內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)微量生化取樣，透析得到的樣品直接經(jīng)在線(xiàn)注射器進(jìn)入HPLC系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得大鼠紋狀體細(xì)胞外液中DA含量為（389.84± 39.92）ng/μL（n=5）。該方法具有在清醒活體動(dòng)物機(jī)體上連續(xù)取樣、動(dòng)態(tài)觀察、定量分析、采樣量小、組織損傷輕等特點(diǎn)。

3.3.3.3 熒光檢測(cè)法 熒光檢測(cè)器是根據(jù)化合物具有熒光性質(zhì)進(jìn)行分析，選擇性高，只對(duì)熒光物質(zhì)有響應(yīng)。靈敏度也相對(duì)較高，適合于多環(huán)芳烴及各種熒光物質(zhì)的痕量分析，也可用于檢測(cè)不發(fā)熒光但經(jīng)衍生反應(yīng)可發(fā)熒光的物質(zhì)。DA與Tb3+形成熒光較強(qiáng)的絡(luò)合物，易被檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)采用反相HPLC結(jié)合熒光檢測(cè)法，梯度洗脫，尤其適合同時(shí)測(cè)定腦組織中多種神經(jīng)單胺類(lèi)遞質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)，樣品預(yù)處理及測(cè)定操作步驟簡(jiǎn)單、靈敏度高、色譜峰分離效果極佳，且洗脫時(shí)間短。

魯燕俠等[21]使用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，單泵流速梯度洗脫，測(cè)得正常小鼠腦內(nèi)左旋DA含量為（110.33±10.56）ng/g。張雷等[22]同樣采用該檢測(cè)方法測(cè)得正常小鼠腦內(nèi)DA含量為（2.35±0.56）μg/g（n=8）。

3.3.4 電位溶出法 電位溶出法以玻碳和汞膜為電極、化學(xué)修飾電極還原計(jì)時(shí)電位溶出，測(cè)定DA含量。該方法儀器簡(jiǎn)單，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中NE、抗壞血酸等均不干擾DA的測(cè)定，有好的選擇性[23]。

4 DA合成酶及其檢測(cè)方法

促進(jìn)DA合成的酶主要有：酪氨酸3-單氧化酶（TH）、氨基酸脫羧酶（AADC）和GCH-Ⅰ。

4.1 DA合成酶

4.1.1 TH 該酶在大腦黑質(zhì)中含量較高，作為一種含鐵的多功能單氧化酶，其功能主要依靠分子氧和輔酶BH4來(lái)實(shí)現(xiàn)。TH是一個(gè)四聚體結(jié)構(gòu)，它具有高度的特異性。Grima等[24]發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)的TH共有4種異構(gòu)體，包括hTH1、hTH2、hTH3、hTH4，其中hTH1的活性較高。TH是催化合成兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的首步，是DA合成的限速酶。TH的催化活性與鐵離子的濃度相關(guān)，在TH發(fā)揮作用的過(guò)程時(shí)，鐵離子經(jīng)氧化后被BH4還原，因此，DA能神經(jīng)元是否產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用，鐵離子的濃度成為了一個(gè)重要的因素。TH通過(guò)催化亞區(qū)和調(diào)節(jié)亞區(qū)相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，繼而合成兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)[25]。

Gautier[26]將人類(lèi)TH通過(guò)HSV載體移植到PD大鼠的紋狀體中，改善了大鼠的PD癥狀，使其腦內(nèi)TH活性增強(qiáng)，DA合成增加，轉(zhuǎn)圈行為也得以改善。Goldman[27]曾經(jīng)將經(jīng)TH修飾的肌細(xì)胞移植入PD模型大鼠的紋狀體內(nèi)，使得PD大鼠的行為學(xué)變化得到明顯改善。

4.1.2 AADC 該酶是催化脫去某種氨基酸的羧基，生成對(duì)應(yīng)胺的裂解酶的總稱(chēng)。AADC作為氨基酸脫羧酶家族成員之一，對(duì)其他芳香族左旋氨基酸也具有脫羧作用，因此，在哺乳動(dòng)物組織中又被稱(chēng)為色氨酸脫羧酶、5-羥色氨酸脫羧酶或多巴胺脫羧酶（dopadecarboxylase，DDC）。

1938年，AADC首次從哺乳動(dòng)物的腎臟中分離出來(lái)；直到1986年，才報(bào)道了果蠅AADC基因的核酸序列[28]；1987年，又從人嗜鉻細(xì)胞瘤克隆出AADC的cDNA并由 cDNA核酸序列得出完整的氨基酸酶序列[29]；1989年，從神經(jīng)細(xì)胞克隆出的人AADC cDNA全長(zhǎng)由1932個(gè)堿基對(duì)組成，其中有1個(gè)開(kāi)放性閱讀框架，編碼480個(gè)氨基酸殘基的蛋白[30]。

劉軍等[31]將AADC轉(zhuǎn)基因骨骼肌細(xì)胞腦內(nèi)移植后，實(shí)驗(yàn)組PD模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為較前明顯改善，并可持續(xù)15周以上，該實(shí)驗(yàn)證明，在補(bǔ)充AADC后，腦內(nèi)紋狀體區(qū)DA含量顯著提高。

4.1.3 GCH-Ⅰ GCH-Ⅰ是BH4合成途徑中的限速酶，BH4又是AADC的必需輔助因子。因此，GCH-Ⅰ活性的缺陷將影響苯丙氨酸代謝和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的合成[32]。

研究表明，PD患者紋狀體內(nèi)，不僅TH和AADC水平下降，GCH-Ⅰ也有顯著降低。在TH、AADC或TH結(jié)合AADC基因治療PD大鼠的基礎(chǔ)上，如若加入GCH-Ⅰ工程細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合基因治療，將能起到更佳的治療效果[33-34]。

4.2 促DA合成酶的檢測(cè)方法 目前DA合成酶檢測(cè)方法主要有檢測(cè)蛋白和基因2種思路。組織染色法、蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法、考馬斯藍(lán)等檢測(cè)蛋白表達(dá)水平的變化，原位雜交法、RT-PCR法及Q-PCR法等能檢測(cè)基因的表達(dá)情況。以上方法能分別從定性、半定量及定量的多層次對(duì)DA合成酶進(jìn)行檢測(cè)。正確的選擇、搭配使用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法，能使研究結(jié)果更加充實(shí)、可信。鑒于DA合成酶中TH發(fā)現(xiàn)時(shí)間較早、含量較高，國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究較全面，下面以TH為例，介紹促DA合成酶的若干檢測(cè)方法。

4.2.1 組織染色法 在對(duì)PD模型大鼠顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)中，常用蘇木精-伊紅（HE）染色法、Nissl染色法、免疫組織化學(xué)法、熒光免疫組織化學(xué)法等。

4.2.1.1 HE染色法 潘琪[35]在觀察蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)大鼠黑質(zhì)變性伴包涵體形成及運(yùn)動(dòng)行為改變的實(shí)驗(yàn)中，采用HE染色法觀察黑質(zhì)致密部病理改變。結(jié)果顯示，模型鼠損毀側(cè)黑質(zhì)致密部神經(jīng)元數(shù)目減少，呈變性改變，神經(jīng)元細(xì)胞膜不完整、結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)嗜伊紅包涵體，膠質(zhì)細(xì)胞增多。

4.2.1.2 Nissl染色法 許耀剛[36]在對(duì)MPTP損傷小鼠慢性PD模型的制作與評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)研究中，用Nissl染色法考察了小鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷程度。其模型組和正常組在該方法下并未體現(xiàn)顯著性差異。封華[37]在評(píng)價(jià)用MPTP誘導(dǎo)C57BL/6j小鼠PD臨床前期模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，Nissl染色結(jié)果顯示，模型組小鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)散在固縮的神經(jīng)元，正常對(duì)照組小鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常。

4.2.1.3 免疫組織化學(xué)法 TH免疫組疫組織化學(xué)法結(jié)果作為PD模型的典型病理檢測(cè)指標(biāo)，在PD實(shí)驗(yàn)研究中具有重要參考價(jià)值。季正劍[38]在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療PD的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，模型損毀側(cè)黑質(zhì)致密帶內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目較正常對(duì)照組顯著減少，達(dá)90%以上，神經(jīng)細(xì)胞幾乎消失，殘存細(xì)胞萎縮，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。損毀側(cè)紋狀體內(nèi)無(wú)明顯TH陽(yáng)性細(xì)胞，表明損毀側(cè)紋狀體內(nèi)DA能神經(jīng)元已變性壞死。

4.2.1.4 熒光免疫組織化學(xué)法 在電針對(duì)震顫麻痹大鼠中腦黑質(zhì)和腎上腺髓質(zhì)TH的影響實(shí)驗(yàn)中，羅明富等[39]發(fā)現(xiàn)，健側(cè)黑質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)有TH陽(yáng)性細(xì)胞，電針組的TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，而且熒光亮度也比對(duì)照組強(qiáng)。

4.2.2 Western blooting 該法是利用聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳檢測(cè)樣品中特定蛋白的方法。劉曉志等[40]在腦內(nèi)移植神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞治療大鼠PD的研究實(shí)驗(yàn)中，提取模型動(dòng)物中腦黑質(zhì)蛋白進(jìn)行TH蛋白檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，損毀側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH蛋白免疫反應(yīng)明顯低于模型動(dòng)物正常側(cè)黑質(zhì)區(qū)，對(duì)照組中正常大鼠左右腦不存在顯著差異，對(duì)照組動(dòng)物和模型動(dòng)物正常側(cè)黑質(zhì)區(qū)不存在顯著差異。在研究左旋多巴對(duì)PD模型大鼠結(jié)腸TH和突觸核蛋白表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)中，畢樹(shù)立等[41]用Western blooting法檢測(cè)PD模型大鼠、左旋多巴治療大鼠的結(jié)腸TH表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型組、治療組各時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸TH陽(yáng)性細(xì)胞及蛋白表達(dá)均明顯減少，與模型組比較，治療組各時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸TH陽(yáng)性細(xì)胞及蛋白表達(dá)均增多。

4.2.3 原位雜交法 為了進(jìn)一步研究PD細(xì)胞凋亡分子病理機(jī)制，劉新紅等[42]利用原位雜交法檢測(cè)PD大鼠TH mRNA在黒質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)變化。采用針對(duì)大鼠Parkin靶基因的mRNA序列作為探針，其探針均經(jīng)地高辛標(biāo)記。結(jié)果顯示，TH mRNA表達(dá)在模型鼠術(shù)后3 d損傷側(cè)黑質(zhì)中開(kāi)始減少，7 d組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯下降，14 d組可見(jiàn)少量殘存的TH陽(yáng)性細(xì)胞，28 d組又開(kāi)始見(jiàn)很少量的TH陽(yáng)性細(xì)胞，各組與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

4.2.4 RT-PCR法 RT-PCR是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形，用于多種基因的檢測(cè)。在DA合成相關(guān)酶基因聯(lián)合治療PD大鼠模型的研究實(shí)驗(yàn)中，魯玲玲等[43]用含重組病毒AAV-TH、AAV-AADC和AAV-GCH-Ⅰ的上清液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）進(jìn)行體外感染；將攜帶有TH、AADC和GCH-Ⅰ基因重組假病毒顆粒感染BMSCs后植入PD模型大鼠損傷側(cè)紋狀體內(nèi)。再通過(guò)RTPCR方法在移植后12周檢測(cè)上述3種基因。結(jié)果顯示，在LacZ組中未見(jiàn)目的基因表達(dá)，而hTH+hGCH-Ⅰ組、hTH+hAADC組和三基因組中分別獲得與預(yù)期條帶相當(dāng)?shù)膆TH、hGCH-Ⅰ、hAADC基因表達(dá)產(chǎn)物。其中陽(yáng)性神經(jīng)元主要分布在針道周?chē)募y狀體內(nèi)，部分陽(yáng)性神經(jīng)元分布于同側(cè)胼胝體及皮質(zhì)區(qū)。

4.2.5 Q-PCR法 何珊[44]在PD模型大鼠腦內(nèi)TH表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究中，采用熒光定量PCR方法測(cè)定大鼠腦內(nèi)TH mRNA水平。實(shí)驗(yàn)通過(guò)正常大鼠腦內(nèi)TH mRNA表達(dá)水平的變化研究模型大鼠腦內(nèi)TH mRNA表達(dá)水平的變化，進(jìn)而分析TH mRNA水平與PD的關(guān)系。結(jié)果表明，正常大鼠左右腦TH基因的表達(dá)無(wú)顯著差異，術(shù)后3周的成功PD大鼠損毀側(cè)腦TH mRNA的表達(dá)量約是對(duì)照側(cè)腦的57.4%；術(shù)后6周的成功PD大鼠損毀側(cè)腦THmRNA的表達(dá)量約是對(duì)照側(cè)腦的31.7%，術(shù)后8周，成功PD大鼠損毀側(cè)腦TH mRNA的表達(dá)量約是對(duì)照側(cè)腦的39.9%。

綜上所述，DA及其合成限速酶與PD息息相關(guān)。在PD模型大鼠腦內(nèi)紋狀體中，DA及其相關(guān)限速酶含量顯著低于正常水平。通過(guò)補(bǔ)充外源左旋多巴，DA其相關(guān)的合成限速酶陽(yáng)性細(xì)胞及蛋白表達(dá)增多；同樣，經(jīng)導(dǎo)與DA合成相關(guān)限速酶的基因治療后，DA合成量隨之增加，病情在行為學(xué)上也得以改善。此規(guī)律對(duì)PD的臨床治療起到指向性作用。正確且科學(xué)地選擇DA及其合成酶的檢測(cè)方法，也必將助力于PD的實(shí)驗(yàn)開(kāi)展。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.21.014

A

1009-5519（2015）21-3244-05

2015-07-06）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31172284）。

臧矯（1990-），女，江蘇常州人，在讀碩士研究生，主要從事比較分析醫(yī)學(xué)帕金森病動(dòng)物模型的研究；E-mail：365086405@qq.com。

邢華（E-mail：184937646@qq.com）。