李曉華,張 偉,董 齊，邵會權(quán)

?

·論著·

中青年復發(fā)性腦梗死與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性相關(guān)性研究

李曉華,張 偉,董 齊，邵會權(quán)

目的 探討亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T位點多態(tài)性與中青年復發(fā)性腦梗死(RIS)的關(guān)系。方法 選取2010年1月—2014年8月齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的中青年RIS患者126例為復發(fā)組，另選擇同時期收治的首次發(fā)病的中青年腦梗死患者130例為首發(fā)組，采用聚合酶鏈反應-限制片段長度多態(tài)性法檢測分析MTHFR基因C677T位點多態(tài)性；采用高效液相色譜法測定血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平，采用全自動電化學發(fā)光免疫分析儀檢測血漿維生素B12、葉酸水平。結(jié)果 復發(fā)組患者高血壓病史、吸煙率均高于首發(fā)組(P<0.05)。兩組患者MTHFR基因C677T位點基因型分布比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；復發(fā)組患者T等位基因頻率較首發(fā)組升高(P<0.05)。復發(fā)組TT、CC基因型患者血漿Hcy水平較首發(fā)組TT、CC基因型患者升高(P<0.05)；兩組TC基因型患者血漿Hcy水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組CT、CC基因型患者血漿維生素B12、葉酸水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩組TT基因型患者血漿維生素B12水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；復發(fā)組TT基因型患者血漿葉酸水平較首發(fā)組TT基因型患者降低(P<0.05)。結(jié)論 MTHFR基因TT基因型是中青年RIS的重要因素，TT基因型中青年RIS患者存在高Hcy及低葉酸，建議對此類患者應盡早合理補充葉酸。

腦梗死；復發(fā)；亞甲基四氫葉酸還原酶；基因；多態(tài)性,單核苷酸

李曉華,張偉,董齊，等.中青年復發(fā)性腦梗死與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性相關(guān)性研究[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(21)：2516-2519.[www.chinagp.net]

Li XH,Zhang W,Dong Q,et al.Correlation between the polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase gene and recurrent cerebral infarction in young and middle-aged people[J].Chinese General Practice，2015，18(21)：2516-2519.

腦血管疾病具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率和高復發(fā)率等特點，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)評估，我國每年死于腦血管疾病者(約182萬人)居聯(lián)合國192個成員國之首[1]。據(jù)《全國疾病監(jiān)測系統(tǒng)死因監(jiān)測數(shù)據(jù)集》分析，2006—2010年我國腦血管疾病死亡人數(shù)達452 906例(死亡率124.01/10萬)[2]。腦梗死是腦血管疾病中最常見類型，約占75%，其半年復發(fā)率為8.8%，1年復發(fā)率為6.0%，5年復發(fā)率為16.0%[3]?？梢姀桶l(fā)性腦梗死(RIS)的發(fā)生率較高，且RIS的致死率、致殘率更高，預后更差。關(guān)于RIS危險因素的研究日益成為熱點，且有不少學者將分子生物學技術(shù)和人類基因組引入到本領(lǐng)域的研究中。但隨著RIS發(fā)生的年輕化，關(guān)于中青年RIS基因水平的探討較為有限，本研究擬對本院收治的中青年RIS患者進行亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T位點檢測，分析了解MTHFR基因多態(tài)性與中青年RIS的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2010年1月—2014年8月齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的中青年RIS患者126例為復發(fā)組，其中男85例，女41例；年齡42～59歲，平均年齡(54.5±1.1)歲；平均復發(fā)時間(1.6±0.2)個月。另選擇同時期本院收治的首次發(fā)病的中青年腦梗死患者130例為首發(fā)組，其中男67例，女63例；年齡41～57歲，平均年齡(54.3±0.9)歲。兩組患者性別構(gòu)成比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.72，P=0.01)；兩組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.59，P=0.11)。

1.2 納入與排除標準 入選患者均符合《各類腦血管病診斷要點》(中華醫(yī)學會第四屆全國腦血管病學術(shù)會議)[4]，并經(jīng)顱腦CT或MRI檢查確診為腦梗死。RIS診斷標準：患者在原神經(jīng)缺失癥狀及體征好轉(zhuǎn)或消失后，超過1個月后再次出現(xiàn)同側(cè)或?qū)?cè)神經(jīng)缺失癥狀或體征，并經(jīng)顱腦CT或MRI檢查發(fā)現(xiàn)有新的病灶，同時排除其他原因引起的腦梗死[2]。根據(jù)2000年WHO人類年齡段劃分標準[5]：青年<44歲，中年45～59歲，故本次納入患者年齡需在18～59歲?；颊呔鶠樵诒镜鼐幼?20年者。

排除標準：近3個月服用維生素、葉酸、左旋多巴、利尿劑等藥物；嚴重器質(zhì)性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾?。桓文I功能不全、甲狀腺疾病、消化不良、糖尿病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾?。粌山M間患者有一、二、三級血緣關(guān)系者。

1.3 方法 入選患者均于入院當日22:00開始禁食，次日8:00空腹時采集肘靜脈血9 ml，分3份于乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)抗凝管中，其中2管2 ml，1管5 ml，并置于4 ℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.3.1 MTHFR基因測定 (1)取2 ml靜脈血，于采血后 1 h內(nèi)3 500 r/min離心10 min(離心半徑13.5 cm)。用人全血DNA提取試劑盒(離心柱型，小量樣品，<1 ml，編號GK1042，上海捷瑞生物工程有限公司)提取DNA，操作按試劑盒說明書進行，并于-20 ℃保存。(2)應用聚合酶鏈反應(PCR)法擴增：應用primer 5.0設計PCR擴增引物，擴增片段長度為655 bp，PCR體系為25 μl；反應條件為95 ℃預變性5 min，進入循環(huán)，94 ℃變性30 s，60 ℃復性45 s，70 ℃延伸1 min，共36個循環(huán)，后72 ℃延伸10 min，4 ℃終止。(3)限制片段長度多態(tài)性(RFLP)分析：20 μl反應體系中加入2 μl酶切緩沖溶液，15 U HinfⅠ限制性內(nèi)切酶，1 μl去離子水補足至20 μl；在37 ℃恒溫箱中消化3 h后取出，采用紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA濃度、純度。

1.3.2 血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平測定 取5 ml靜脈血，在取血后30 min完成如下操作，4 ℃、3 000 r/min離心10 min(離心半徑13.5 cm)，分離出上層血漿標本置于-80 ℃保存；采用高效液相色譜儀(P1201依利特，大連依利特分析儀器有限公司)及熒光探測儀(LIFD230 激光誘導熒光檢測器，大連依利特分析儀器有限公司)測定血漿Hcy水平，質(zhì)控標準為Sigm公司提供的Hcy標準品。

1.3.3 血漿維生素B12、葉酸水平測定 取2 ml靜脈血，采用全自動電化學發(fā)光免疫分析儀〔ELEC-SYC-2010，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司〕檢測血漿維生素B12、葉酸水平。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢測 MTHFR基因C677T位點基因型分布在復發(fā)組與首發(fā)組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，具有群體代表性。

2.2 兩組患者高血壓病史及吸煙、飲酒率比較 復發(fā)組患者高血壓病史、吸煙率均高于首發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩組患者飲酒率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 兩組患者高血壓病史及吸煙、飲酒率比較〔n(%)〕

Table 1 Comparison of the rates of hypertension history,smoking and drinking rate between the two groups

組別例數(shù)高血壓病史吸煙飲酒復發(fā)組12692(73.0)50(39.7)44(34.9)首發(fā)組13079(60.8)36(27.7)34(26.2)χ2值4.334.122.32P值0.040.040.13

2.3 兩組患者MTHFR基因C677T位點基因型分布及等位基因頻率比較 兩組患者MTHFR基因C677T位點基因型分布比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；復發(fā)組患者T等位基因頻率較首發(fā)組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 兩組患者MTHFR基因C677T位點基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table 2 Comparison of genotype distribution and allele frequency of MTHFR gene C677T between the two groups

組別例數(shù)基因型CC CT TT 等位基因C T復發(fā)組12625(19.8)56(44.4)45(35.7)55(43.6)71(56.3)首發(fā)組13044(33.8)55(42.3)31(23.8)76(58.5)54(41.5)χ2值7.765.62P值0.020.02

2.4 兩組不同基因型患者血漿Hcy水平比較 復發(fā)組TT、CC基因型患者血漿Hcy水平較首發(fā)組TT、CC基因型患者升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩組TC基因型患者血漿Hcy水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3)。

Table 3 Comparison of plasma Hcy levels in patients with different genotypes between the two groups

組別TT例數(shù) HcyCT例數(shù) HcyCC例數(shù) Hcy復發(fā)組2531.3±8.35624.8±6.14522.1±5.5首發(fā)組4427.9±7.05523.4±5.13120.4±6.0t值3.501.842.39P值<0.010.070.02

注：Hcy=同型胱氨酸

2.5 兩組不同基因型患者血漿維生素B12、葉酸水平比較 兩組CT、CC基因型患者血漿維生素B12、葉酸水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩組TT基因型患者血漿維生素B12水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；復發(fā)組TT基因型患者血漿葉酸水平較首發(fā)組TT基因型患者降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表4)。

3 討論

在腦梗死復發(fā)危險因素中，高血壓、吸煙、飲酒已被多項研究表明是重要因素[6-7]。本研究中，復發(fā)組高血壓病史、吸煙率高于首發(fā)組，且復發(fā)組男性比例高于首發(fā)組。姜巖等[8]在對240例中青年腦梗死患者進行復發(fā)危險因素研究中發(fā)現(xiàn)，復發(fā)組高血壓病史、吸煙率、飲酒率均高于初發(fā)組(分別高出25.8%、10.0%、8.4%)。本研究中，兩組間性別構(gòu)成有差異，但是否構(gòu)成危險因素有待下一步研究觀察。

本研究結(jié)果顯示，兩組間MTHFR基因C677T位點基因型分布有差異，且復發(fā)組T等位基因頻率高于首發(fā)組，說明MTHER基因C677T位點基因突變在RIS發(fā)生中扮演了重要角色。MTHFR基因C677T位點是目前研究的熱點，位于重要的功能結(jié)構(gòu)區(qū)中，該突變位點在MTHFR基因的N端，可影響酶的耐熱性、活性變化[9]。

表4 兩組不同基因型患者血漿維生素B12、葉酸水平比較

杜麗麗等[10]在研究我國人群MTHFR基因分布情況時指出，MTHFR基因是Hcy代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其C677T位點多態(tài)性與血脂水平有一定關(guān)系。本研究在MTHFR基因型與血漿Hcy水平關(guān)系的觀察中顯示，復發(fā)組TT基因型患者Hcy水平高于首發(fā)組。蔣萍等[11]在關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性研究中指出，TT基因型患者的酶活性僅為正常的30%，因此TT基因型患者血漿Hcy水平明顯高于純合野生型CC基因型患者。陳星霖[12]在對比147例腦卒中患者與188例健康人時發(fā)現(xiàn)，病例組TT基因型和CT基因型患者血漿高Hcy檢出率明顯高于正常組，且Hcy水平TT基因型最高。

葉酸是從食物中提取出來的一種B族維生素，與維生素B12共同參與Hcy再甲基化過程[13-14]。本研究中，復發(fā)組TT基因型患者葉酸水平低于首發(fā)組，由于葉酸在Hcy代謝中的作用，其水平降低則易導致高Hcy，而高Hcy是RIS發(fā)生的重要因素?？梢姡琈THRF基因C677T位點TT基因型者發(fā)生RIS可能性較大。

綜上所述，中青年RIS發(fā)生與MTHRF基因C677T位點的關(guān)系甚密，其中TT基因型者Hcy水平升高，并存在葉酸低水平的情況。因此，對初發(fā)腦梗死者進行MTHFR基因篩選，并對TT基因型患者進行葉酸干預，積極控制血壓、戒煙對預防中青年RIS的發(fā)生有積極意義。

[1]Cui ZQ,Gu X,Wang HD,et al.Epidemiology of cerebrovascular disease mortality in China,2006—2010[J].Disease Surveillance，2013，28(12)：1007-1011.(in Chinese) 崔琮琪，谷鑫，王海東，等.2006—2010年中國居民腦血管病死亡流行病學特征研究[J].疾病監(jiān)測，2013，28(12)：1007-1011.

[2]劉一爾，林燕妮.復發(fā)性腦梗死與血漿同型半胱氨酸的相關(guān)性觀察與分析[J].河北醫(yī)學，2012,18(10)：1437-1439.

[3] Meng LM,Wu SL,Wang SJ,et al.Prospective study of serum uric acid and risk of brain infarction[J].Chinese Journal of Neurology,2013,46(12)：527-529.(in Chinese) 孟令民，吳壽嶺，王淑娟，等.血尿酸與腦梗死發(fā)病的關(guān)系[J].中華神經(jīng)科雜志，2013,46(12)：527-529.

[4]中華醫(yī)學會第四屆全國腦血管病學術(shù)會議.各類腦血管病診斷要點[J].中華神經(jīng)內(nèi)科雜志，1996,29(6)：379.

[5]人類年齡段劃分新標準[J].現(xiàn)在代養(yǎng)生，2005(9)：16.

[6]蔣敏，李洪亮，黃文忠.進展性腦梗死危險因素分析[J]. 神經(jīng)損傷與功能重建,2013,8(6):461-461, 465.

[7]張俊，朱本亮，袁勇.腦梗死各種危險因素的相關(guān)性研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2012，20(10)：1601.

[8]Jiang Y,Li XH,Zhang M,et al.Study on relationship between homocysteine and young and middle-aged patients with recurrent cerebral infarction[J].Chinese Journal of Misdiagnostics，2010,10(9)：2017-2018.(in Chinese) 姜巖，李曉華，張敏，等.同型半胱氨酸與中青年復發(fā)腦梗死的相關(guān)性研究[J].中國誤診學雜志，2010,10(9)：2017-2018.

[9]Wang Q,Liu J,Liu YP.Methylenetetrahydrofolate reductase deficiency-induced schizophrenia in a school-age boy[J].Chinese Journal of Contemporary Pediatrics，2014,16(1)：167-169.(in Chinese) 王峭，劉靖，劉玉鵬.亞甲基四氫葉酸還原酶缺陷導致學童精神分裂癥[J].中國當代兒科雜志，2014,16(1)：167-169.

[10]Du LL,Lyu ZP,Liu CW,et al.Association between the MTHFR C677T polymorphism and serum lipid levels and longevity in the long-lived cohort in Guangxi Hongshuihe river basin[J].Chinese Journal of Arteriosclerosis,2013,21(4)：637-639.(in Chinese) 杜麗麗，呂澤平，劉承武，等.廣西紅水河流域長壽人群MTHFR C677T基因多態(tài)性與血脂水平的相關(guān)性[J].中國動脈硬化雜志，2013,21(4)：637-639.

[11]Jiang P,Zang DW.Correlation between polymorphisms of MTHFRC677T gene and plasma homocysteine in patients with acute cerebral infarction[J].Shandong Medical Journal，2014,54(8)：1-4,8.(in Chinese) 蔣萍，臧大維.急性腦梗死患者MTHFR基因多態(tài)性與血漿同型半胱氨酸水平的關(guān)系[J].山東醫(yī)藥，2014,54(8)：1-4,8.

[12]陳星霖.MTHF+C677T基因突變及血漿tHcy水平與腦卒中關(guān)系的研究[D].武漢：華中科技大學，2012.

[13]李建新.高同型半胱氨酸血癥對急性腦梗死患者短期預后的影響[D].西安：第四軍醫(yī)大學，2013.

[14]曾憲卿，何俊.急性腦梗死患者血漿同型半胱氨酸及其相關(guān)硫醇物、葉酸、維生素B12水平變化及相關(guān)性研究[J]. 神經(jīng)損傷與功能重建,2013,8(1):26-29.

(本文編輯：陳素芳)

Correlation Between the Polymorphism of Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene and Recurrent Cerebral Infarction in Young and Middle-aged People

LIXiao-hua,ZHANGWei,DONGQi,etal.

TheThirdAffiliatedHospitalofQiqiharMedicalSchool,Qiqihar161000,China

Objective To explore the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) C677T gene polymorphism and recurrent cerebral infarction in young and middle-aged people.Methods We enrolled 126 young and middle-aged patients with recurrent cerebral infarction who were admitted into the Neurology Department of the Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical School from January 2010 to August 2014 as relapse group.And another 130 young and middle-aged patients with first-episode cerebral infarction who were admitted into the hospital in the same period were enrolled as first-episode group.The polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) method was used to analyze the MTHFR C677T gene polymorphism.Plasma total homocysteine(Hcy) level was measured using high performance liquid chromatography,and the level of vitamin B12and folic acid were measured by automatic electrochemiluminescence immunoassay analyzer.Results The relapse group was higher(P<0.05) than the first-episode group in the rate of patients with history of hypertension and smoking rate.Significant difference(P<0.05) was noted in the genotype distribution of MTHFR C677T gene between the two groups;the relapse group was higher(P<0.05) than the first-episode group in T-allele frequency.The relapse group was higher(P<0.05) than the first-episode group in Hcy level in patients with TT or CC genotype;the two groups were not significantly different(P>0.05) in Hcy level in patients with TC genotype.The two groups were not significantly different(P>0.05) in the levels of vitamin B12and folic acid in patients with CT or CC genotype;the two groups were not significantly different(P>0.05) in the level of vitamin B12in patients with TT genotype;the relapse group was lower than the first-episode group in the level of folic acid in patients with TT genotype.Conclusion TT genotype of MTHFR gene is an important factor for recurrent cerebral infarction in young and middle-aged people.Young and middle-aged people have high Hcy level,low vitamin B12level and low folic acid level.We suggest that group of patients supplement vitamin B12and folic acid in a rational way and as early as possible.

Brain infarction；Recurrence；Methylenetetrahydrofolate reductase；Genes；Polymorphism,single nucleotide

161000黑龍江省齊齊哈爾市，齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院(李曉華,張偉，邵會權(quán))；哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院(董齊)

邵會權(quán)，161000 黑龍江省齊齊哈爾市，齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院；E-mail：lxh004100@163.coms

R 743.33

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.21.006

2014-10-21；

2015-06-08)