陳江生 李志祥 宋明浩 凌畢益

深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東深圳 518105

創(chuàng)傷性腦損傷是45 歲以下成年人致死和致殘的重要原因，創(chuàng)傷性腦損傷不僅會讓大多數(shù)患者遺留不同程度的殘疾，同時也給社會和家庭帶來沉重的社會和經(jīng)濟負擔。氧自由基損傷是影響創(chuàng)傷性腦損傷預后極其重要的一個影響因素，而葛根素為一個有效的氧自由基清除劑，因此本實驗構建創(chuàng)傷性腦損傷動物模型，并且以葛根素干預，以探討葛根素是否具有創(chuàng)性腦損傷保護作用。

1 材料與方法

1.1 模型制作

選擇健康成年雄性SD 大鼠40 只[由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供， 實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013 ～0002]，體 重250~300g。根 據(jù)Brody 等建立的定量腦皮質(zhì)挫傷（controlled cortical impact injury，CCI）方法[1]構建腦損傷的模型，具體操作為：實驗前大鼠需禁食12h。首先大鼠經(jīng)2% 50mg/kg 戊巴比妥腹腔注射麻醉后，選擇仰臥位于立體定向頭架上，無菌條件下在中線將頭皮切開，將骨膜剝離，暴露出右頂骨。矢狀縫中線旁開2.5mm，在人字縫與冠狀縫中鉆一直徑為5mm 骨孔，暴露出硬腦膜。于腦立體定位儀上安裝電磁顱腦損傷撞擊器的傳動裝置，經(jīng)使用腦立體定位儀操縱臂使撞擊頭與鼠頭矢狀面呈80°，與冠狀面平行呈垂直在大鼠硬腦膜上固定，使硬腦膜與撞擊頭末端相垂直。經(jīng)撞擊器設置，用5mm 直徑的撞擊頭，且以3m/s 速度，2mm 打擊深度，120ms 打擊時間中制作中度創(chuàng)傷性腦損傷。創(chuàng)傷性腦損傷后應立即將撞擊器移除，后縫合頭皮切口。在出現(xiàn)自主呼吸恢復后，大鼠重新進入飼養(yǎng)籠，行損傷后觀察，假手術大鼠手術與麻醉程序同上，但無沖擊損傷過程。對于葛根素治療組的大鼠，在CCI 模型制作后15min，腹腔注射葛根素（60mg/kg）。

1.2 實驗分組

將SD 大鼠分為四組：損傷組（A 組）和假手術組（B 組），葛根素治療的損傷組（C 組）和葛根素治療的假手術組（D 組）。A 組大鼠進接收CCI 模型，B 組大鼠為假手術組，作為陰性對照，C 組大鼠為CCI 模型合并葛根素治療，作為葛根素治療組，而D組大鼠為假手術組合并葛根素治療，作為本底對照組。

1.3 測定指標和方法

1.3.1 神經(jīng)功能缺損評分（mNSS） 采用改良的神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）（表1）對四組動物創(chuàng)傷性腦損傷后7d 神經(jīng)功能損傷情況進行評價。經(jīng)mNSS 評分，包括肢體運動、感覺、翻身、平衡與協(xié)調(diào)，為0~18 分，分數(shù)越高則神經(jīng)功能缺損越嚴重。

表1 改良的神經(jīng)功能缺損評分

1.3.2 腦組織干濕重比 采用干濕重稱量法得出四組試驗動物損傷24h 后腦組織含水量，具體操作：先將腦組織取樣，用甲醛固定后，稱取重量，然后將腦組織在真空條件下60℃烘干，24h 后，稱重；同樣方法測的損傷后脊髓的重量。含水量=（腦濕重－腦干重 ）/腦干重。

1.3.3 腦組織MDA 含量 SD 大鼠斷頸處死后，迅速取出大腦，用冰冷的pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液）制備10%腦勻漿，離心后取上清液進行受損側腦組織中MDA 含量，測定步驟按試劑盒說明書進行，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 葛根素對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)功能的影響

在創(chuàng)傷性腦損傷模型中（TBI）后，兩組均出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)功能缺損，而葛根素能明顯減輕神經(jīng)功能缺損，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=3.09，P=0.013）。見圖1。

圖1 神經(jīng)功能缺損評分。 與創(chuàng)傷性腦損傷組相比（B組），*P＜0.05

2.2 葛根素對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后腦組織水腫的影響

假手術組中大鼠腦組織干濕重比無差異，且未出現(xiàn)腦水腫。而在創(chuàng)傷性腦損傷后，大鼠腦組織的干濕重比明顯增高，而與B 組相比，給以葛根素治療組（C 組）的干濕重比顯著降低（t=8.01，P=0.000）。見圖2。

圖2 腦組織干濕重比。與創(chuàng)傷性腦損傷組相比（B 組），*P ＜0.05

2.3 葛根素對創(chuàng)傷性腦損傷后腦組織氧化應激產(chǎn)物MDA含量的影響

創(chuàng)傷性腦損傷后，B 組和C 組腦組織的氧化應激產(chǎn)物MDA 含量均顯著升高（t1=10.7，P1=0.000；t2=9.85，P2=0.000）。而與B 組相比，葛根素能顯著減少MDA 含量的升高程度（t=6.43，P=0.002）。見圖3。

圖3 腦組織中MDA 水平。與創(chuàng)傷性腦損傷組相比（B組），*P<0.05，與假手術組相比（A 組），#P<0.05

3 討論

迄今為止，尚無經(jīng)FDA 批準的用于治療急性創(chuàng)傷性腦損傷的藥物上市。而目前對于急性創(chuàng)傷性腦損傷的治療多是基于緩解腦損傷的一些輔助治療方法，例如脫水、減輕血管痙攣等。而引起創(chuàng)傷性腦損傷進展的因素既包括初次外傷引起的腦組織的，也包括繼發(fā)性的腦水腫、腦缺血、炎性反應、氧化應激反應等病理生理機制引起的二次腦損傷[2-3]。而氧自由基的堆積被認為是創(chuàng)傷性腦損傷病理生理過程中極其重要的一個因素。氧化應激（oxidative stress，OS）是體內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基所介導的一種反應，導致機體氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡從而造成組織損傷，并認為其失衡是導致衰老和疾病的一個重要因素之一。因而，維持氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡，可以有效地對抗氧化應激損傷[4-6]。

葛根素（Puerarin）是從豆科植物葛的根中提取的一種異黃酮成分，是一種天然的抗氧化劑，能有效的清除氧自由基，對多種氧化應激損傷具有保護作用，例如對心肌缺血、心肌缺血再灌注損傷和對老年癡呆也有保護作用[7-8]。近來發(fā)現(xiàn)葛根素對神經(jīng)系統(tǒng)疾病也具有保護作用，例如中風和蛛網(wǎng)膜下腔出血[9-10]。在此項實驗中，我們發(fā)現(xiàn)葛根素能有效減輕創(chuàng)傷性腦損傷動物模型中的神經(jīng)功能缺損、腦水腫情況，也能顯著減少因氧化應激損傷造成的氧化應激MDA 活性的升高程度。

基于目前的研究，葛根素的抗氧化機制也是非常復雜[11]。有研究表明葛根素能顯著減少eNOS 蛋白和基因的表達，從而減輕氧化應激損傷，減輕心肌的缺血性損傷，這一保護作用可能由PI3K/AKT信號通路介導[12]。同時，葛根素也能通過cAMP 和cGMP 信號通路減輕Ca2+內(nèi)流，從而起到抗血管收縮的作用。

雖然本實驗發(fā)現(xiàn)了葛根素能有效的減輕創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)功能缺失和腦水腫，并能提高抗氧化酶SOD 的活性，但是對于其具體作用機制尚未闡明。有文獻表明創(chuàng)傷性腦損傷的氧化應激損傷與Nrf2-ARE 通路密切相關[13]，是否葛根素是通過這一信號通路起作用需要進一步實驗進行證明。

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