張 權(quán)，周 泉，何 艷，龔國(guó)忠，鄭煜煌，周華英，黃 娜

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RNA干擾作用于HIV-1vpr基因的篩選實(shí)驗(yàn)研究

張 權(quán)，周 泉，何 艷，龔國(guó)忠，鄭煜煌，周華英，黃 娜

目的 篩選鑒定針對(duì)HlV-1vpr基因的小干擾RNA(siRNA)片段。方法 根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)要求合成siRNA56、siRNA160和siRNA185寡核苷酸片段，分別轉(zhuǎn)染至含HIV-1vpr質(zhì)粒的HEK 293T細(xì)胞，并進(jìn)行總RNA提取，采用Real-time PCR和Western blotting分別從核酸和蛋白水平對(duì)HIV-1vpr基因表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 siRNAs成功轉(zhuǎn)染含HIV-1vpr質(zhì)粒的HEK 293T細(xì)胞，降低了HIV-1vpr基因的表達(dá)水平，其中在RNA水平siRNA160組干擾抑制作用最強(qiáng)，抑制率為89%；在蛋白水平siRNA56組干擾抑制作用最強(qiáng)，抑制率為96%。結(jié)論 3個(gè)基因片段的siRNA均可以下調(diào)HIV-1vpr的表達(dá)水平，但存在差異性，為探索HIV/AIDS基因治療的可行性和高效性提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

RNA干擾；HIV-1；HIV-1vpr基因；HEK293T細(xì)胞

張權(quán)，周泉，何艷，等.RNA干擾作用于HIV-1vpr基因的篩選實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(14)：1671-1674.[www.chinagp.net]

Zhang Q，Zhou Q，He Y，et al.Screen and identify RNA interference on HIV-1vpr gene[J].Chinese General Practice，2015，18(14)：1671-1674.

目前HIV感染者/AIDS患者的主要治療手段仍是高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法 (HAART)，即通過(guò)不同的藥物聯(lián)合抑制HIV感染者體內(nèi)的病毒載量，改善免疫重建，減少和延緩機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生[1]，但HAART不能完全清除病毒，且存在治療費(fèi)用高、需終身聯(lián)合服藥、毒副作用大及產(chǎn)生耐藥突變等缺點(diǎn)[2-3]，所以研究者在不斷開(kāi)發(fā)新的治療手段。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)即是近年來(lái)在基因治療領(lǐng)域中的新進(jìn)展，在抗腫瘤、抗病毒等方面有較好的應(yīng)用前景。

HIV-1vpr基因?qū)儆贖IV基因組的4個(gè)輔助基因之一，編碼一個(gè)96氨基酸、14 kDa分子量的堿性vpr輔助蛋白，有促進(jìn)病毒整合前復(fù)合物(PIC)的核運(yùn)輸[4]、調(diào)節(jié)促進(jìn)宿主基因轉(zhuǎn)錄[5]、反式激活HIV長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)及某些異質(zhì)啟動(dòng)子[6]、誘導(dǎo)宿主細(xì)胞G2/M期的停滯[7]、致感染細(xì)胞的凋亡[8]、抑制細(xì)胞內(nèi)pre-mRNA的剪接[9]等多項(xiàng)功能，參與了HIV病毒的多個(gè)致病環(huán)節(jié)和免疫損傷過(guò)程。本研究擬針對(duì)HIV-1vpr基因設(shè)計(jì)相關(guān)的小RNA分子并進(jìn)行篩選鑒定，以確定最佳RNAi片段而進(jìn)行后期研究。

1 材料與方法

1.1 材料 PRNAT-U6.1/Neo-HIV-1vpr質(zhì)粒由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院感染科研究室制備并保存；HEK293T細(xì)胞來(lái)自長(zhǎng)沙艾佳生物技術(shù)有限公司；HIV-1vpr多克隆抗體購(gòu)自Santa公司；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購(gòu)自Jackson公司；SYBR Green qRCR Mix試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物科技研究所。

1.2 方法

1.2.1 HIV-1vpr及β-actin引物合成 采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，并由長(zhǎng)沙艾佳生物技術(shù)有限公司合成，HIV-1vpr上游引物序列為5′-AAGACCAAGGGCCACAGA-3′，下游引物為5′-CTTCCACTCCTGCCCAAGTA-3′,β-actin上游引物為5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′，下游引物為5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′。

1.2.2 小干擾RNA(siRNA)的制備 根據(jù)HIV-1vpr序列，遵循siRNA靶序列選擇要求選定分別對(duì)應(yīng)HIV-1vpr基因不同位點(diǎn)的3段序列，由Invitrogen公司采用化學(xué)合成法合成相應(yīng)的寡核苷酸片段，其中siRNA56序列為5′-CACUAGAGCUUCUAGAGGAGCUUAA-3′，siRNA160：5′-AUAAACAGCAGUUGUUGCAGAGUUC-3′，siRNA185：5′-UGGGCAGGAGUGGAAGCCAUAAUAA-3′。

1.2.3 siRNAs轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞 復(fù)蘇培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，以PRNAT-U6.1/Neo-HIV-1vpr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以僅含質(zhì)粒的單純HEK293T細(xì)胞組為對(duì)照組，將siRNA56、siRNA160、siRNA185 分別制成siRNA-lipo2000混懸液，室溫靜置20 min，分別加至含質(zhì)粒HEK293T細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板中混合，設(shè)為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行細(xì)胞收集，然后分別進(jìn)行Real-time PCR和Western blotting檢測(cè)。

1.2.4 細(xì)胞總RNA的抽提及Real-time PCR 所收集細(xì)胞采用Trizol試劑抽提總RNA，取1 μl進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。并以cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物各1 μl(10 μmol/L)，共30 μl反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件：95 ℃，3 min;95 ℃,10 s;58 ℃,30 s共35個(gè)循環(huán)，每次在延伸階段讀取熒光值。以僅含質(zhì)粒的單純HEK293T細(xì)胞組cDNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 Western blotting檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解樣品，Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)樣品濃度，灌制SDS-PAGE凝膠，上樣，100 V電泳，至溴酚蘭剛跑出玻璃板即終止電泳轉(zhuǎn)膠至PVDF膜，封閉孵育2 h后加入稀釋的HIV-1vpr多克隆抗體(1∶500)孵育過(guò)夜，傾去一抗后加入稀釋的羊抗兔二抗(1∶6 000)孵育1 h，進(jìn)行X線膠片顯影。最后通過(guò)膜再生進(jìn)行內(nèi)參抗體β-actin孵育和顯色并掃描，采用IPP 6.0圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 總RNA樣本提取 電泳圖顯示電泳條帶清晰，大小一致(見(jiàn)圖1)，說(shuō)明siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功。

圖1 4個(gè)樣本總RNA提取電泳圖

2.2 siRNA對(duì)HIV-1vpr的體外干擾作用

2.2.1 Real-time PCR結(jié)果 利用Real-time PCR檢測(cè)各組siRNA干擾效率，對(duì)照組cDNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，繪制相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用相對(duì)定量的方法對(duì)各組進(jìn)行β-actin基因的內(nèi)均一化處理，分析siRNA各組中HIV-1vpr基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，siRNA56組、siRNA160組和siRNA185組HIV-1vpr基因的mRNA水平均明顯降低(對(duì)照組的2-△△Ct值為1.01，siRNA56組、siRNA160組、siRNA185組分別為0.68、0.11、0.59)，其中siRNA56組下降32%，siRNA160組下降89%,siRNA185組下降41%,提示siRNA能有效地下調(diào)HIV-1vpr基因的轉(zhuǎn)錄水平(見(jiàn)圖2)。

圖2 Real-time PCR檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后HIV-1vpr基因轉(zhuǎn)錄水平

Figure 2 Transcription level of siRNAs transfect HIV-1vpr gene detected by Real-time PCR

2.2.2 Western blotting結(jié)果 對(duì)照組在轉(zhuǎn)染48 h后可見(jiàn)HIV-1vpr蛋白呈較高水平表達(dá)，siRNA56組、siRNA160組和siRNA185組均僅見(jiàn)很弱的蛋白表達(dá)條帶，根據(jù)灰度分析發(fā)現(xiàn)siRNA56組HIV-1vpr蛋白表達(dá)水平抑制率為96%，siRNA160組、siRNA185組抑制率分別為37%和52%(見(jiàn)圖3～4)。

圖3 Western blotting檢測(cè)siRNAs轉(zhuǎn)染后干擾效果

圖4 Western blotting檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后HIV-1vpr基因表達(dá)水平

Figure 4 Expression levels of siRNAs transfect HIV-1vpr gene detected by Western blotting

3 討論

3.1 RNAi靶點(diǎn)的選擇 RNAi是近年發(fā)展起來(lái)的可用于抗腫瘤、抗病毒治療的新技術(shù)，而且已有研究證實(shí)此技術(shù)可以有效應(yīng)用于HIV的抗病毒治療，并取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。RNA干擾技術(shù)在HIV感染者/AIDS患者治療方面的研究最初是以HIV-1病毒中編碼下列蛋白的基因作為RNAi的靶點(diǎn)：結(jié)構(gòu)蛋白Gag、Env和Pol酶，調(diào)控蛋白Tat和Rev，以及2個(gè)附屬蛋白Nef和Vif[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)沉默HIV-1的某個(gè)基因可以抑制病毒的復(fù)制，但不同的基因結(jié)果有一定差異。目前針對(duì)HIV-1vpr基因的RNA干擾報(bào)道較少。由于vpr輔助基因在HIV-1的傳播、致病能力和發(fā)病機(jī)制等諸多方面扮演著重要角色，研究HIV-1vpr的作用可能會(huì)進(jìn)一步揭示AIDS的發(fā)病機(jī)制，從而為防治AIDS提供新的策略[13]。本研究選擇此目的基因作為RNAi的靶點(diǎn),篩選針對(duì)HIV-1vpr基因的有效siRNA片段對(duì)HIV-1vpr基因的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行沉默，并分別在核酸和蛋白水平進(jìn)行了驗(yàn)證。

3.2 結(jié)果分析 本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，siRNA56組、siRNA160組和siRNA185組HIV-1vpr基因的mRNA水平均明顯降低，其中siRNA160組抑制率最高，對(duì)靶基因mRNA的降解作用最明顯；而在HIV-1vpr蛋白水平siRNA56組干擾抑制效果最強(qiáng)，達(dá)96%。本研究mRNA水平與蛋白表達(dá)水平不一致,可能是由于mRNA與蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)差異有關(guān)，部分轉(zhuǎn)錄出來(lái)的mRNA可能不參與蛋白翻譯或某些蛋白表達(dá)量達(dá)到一定程度后出現(xiàn)飽和而關(guān)閉表達(dá)，而蛋白產(chǎn)生和降解的速度比較恒定，短期內(nèi)兩者的變化可能不一致；另一方面，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，蛋白表達(dá)可能受到其他旁路通道的影響,或存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。依此推論,mRNA水平的下調(diào)與蛋白水平的下調(diào)并非完全呈正相關(guān)的關(guān)系，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.3 展望 本研究通過(guò)RNAi技術(shù)，應(yīng)用化學(xué)合成的siRNAs寡片段轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，研究vpr基因特異性siRNA的基因沉默作用，實(shí)現(xiàn)高效導(dǎo)入靶細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)siRNA的目的，篩選可有效抑制vpr基因表達(dá)的siRNA序列。目前由于siRNA的分子極性、細(xì)胞毒性及t1/2短等因素，在體內(nèi)的研究受限，為此人們陸續(xù)開(kāi)發(fā)了核酸適配子嵌合體、陽(yáng)離子鈦依賴的scFvCD7-9R抗體復(fù)合物等來(lái)高效介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)從而導(dǎo)致基因沉默[14-15]。但近年來(lái)的報(bào)道無(wú)論針對(duì)免疫逃逸、轉(zhuǎn)染效率還是抑制效率，均認(rèn)為沉默多個(gè)病毒基因或聯(lián)合沉默病毒和宿主基因、相關(guān)的多個(gè)位點(diǎn)較單純采用某一個(gè)靶點(diǎn)更好，且有進(jìn)一步研究證實(shí)構(gòu)建多個(gè)表達(dá)盒的方法較多個(gè)表達(dá)載體法、含數(shù)個(gè)dsRNA單元的單個(gè)轉(zhuǎn)錄法效率更高[16-17]。siRNA對(duì)HIV-1vpr基因在體外細(xì)胞中的表達(dá)有明顯抑制效應(yīng)，這對(duì)于阻斷HIV侵入宿主細(xì)胞及其相互作用有重要啟示，為HIV/AIDS抗病毒治療和預(yù)防研究提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)證實(shí)了RNAi具備高效、穩(wěn)定、簡(jiǎn)單、特異等優(yōu)勢(shì)和潛力，有望成為一種具有良好抗HIV-1療效的新方法。

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(本文編輯：趙躍翠)

Screen and Identify RNA Interference on HIV-1vpr Gene

ZHANGQuan，ZHOUQuan，HEYan，etal.

DepartmentofInfectiousDiseases,theSecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410011,China

Objective To screen and identify fragments of siRNA on HIV-1vpr gene.Methods This study designed and synthesized siRNA56,siRNA160 and siRNA185 oligonucleotide fragments according to siRNA design requirements,transfected them into HEK293T cells containing plasmids of HIV-1vpr genes,extracted total RNA and verified HIV-1vpr from levels of nucleic acid and protein by Real-time PCR and Western blotting.Results The siRNA successfully transfected HEK 293T cells containing HIV-1vpr plasmids and reduced the expression of HIV-1vpr genes.The inhibition rate of siRNA160 group was the highest in RNA level (89%) and that of siRNA56 group was the highest in protein level (96%).Conclusion The siRNAs of three gene fragments,which can decrease the expression HIV-1vpr,provide a reliable and efficient experimental basis for exploration of HIV/AIDs gene treatment.

RNA interference；HIV-1；HIV-1vpr gene；HEK293T cell

湖南省科學(xué)技術(shù)廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014SK3097)

410011湖南省長(zhǎng)沙市，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院感染科

R 394.114

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.14.017

2014-11-25；

2015-01-20)