胡紫璟，毛娟，趙長(zhǎng)增，陳佰鴻，王玉安，趙雙

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所，甘肅 蘭州　730070)

‘李廣杏’幼胚的離體培養(yǎng)

胡紫璟1，毛娟1，趙長(zhǎng)增1，陳佰鴻1，王玉安2，趙雙1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所，甘肅 蘭州730070)

摘要：以‘李廣杏’幼胚(盛花后30～40 d)為試驗(yàn)材料，MS為基本培養(yǎng)基，研究了激素及其不同濃度組合對(duì)幼胚萌發(fā)和胚培苗繼代增殖的影響.結(jié)果表明：幼胚萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L，在培養(yǎng)20 d時(shí)萌發(fā)率達(dá)到100%，子葉生長(zhǎng)健壯，葉片濃綠伸展；胚培苗繼代增殖的適宜培養(yǎng)基配方為MS + 6-BA 1.0 mg/L+ IAA 0.05 mg/L，增殖系數(shù)達(dá)3.42.

關(guān)鍵詞：‘李廣杏’；6-BA；IAA；幼胚離體培養(yǎng)

第一作者：胡紫璟(1989-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡渖锛夹g(shù).E-mail:107331302294@st.gsau.edu.cn

Immature embryo culture on apricot variety

‘Liguangxing’invitro

HU Zi-jing1,MAO Juan1,ZHAO Chang-zeng1,CHEN Bai-hong1,WANG Yu-an2,ZHAO Shuang1

(1.College of Horticulture,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Institute of Fruit and

Floriculture Research,Gansu Academy of Agriculture Sciences,Lanzhou 730070 China)

Abstract：The experiment studied the effects of various plant growth regulators and their different concentration combinations on immature embryo germination and embryo seedlings subculture proliferation of apricot variety Liguangxing.Using young embryos (30 d to 40 d after full blooming) were used as experimental materials and MS was the basic medium.The result indicated that the immature embryo grew well on MS+6-BA 0.5 mg/L+ IAA 0.2 mg/L medium during its primary culture.Under this processing,the germination rate reached 100% at 20 th day,cotyledons grew strongly,leaves dark green and stretch.The suitable subculture medium of immature embryos is MS + 6-BA 1.0 mg/L +IAA 0.05 mg/L.Under this treatment,the propagation coefficient reached 3.42.The techniques of immature embryo culture of apricot variety ‘Liguangxing’ in vitro are established in this study,which lay a foundation for its cross breeding and genetic transformation.

Key words：apricot variety ‘Liguangxing’;6-BA;IAA;immature embryo culture in vitro

胚培養(yǎng)是果樹育種中克服自交不親合以及雜種胚早期敗育的主要技術(shù)之一[1-3]，是直接應(yīng)用于植物改良最早的組織培養(yǎng)技術(shù).核果類果樹胚培養(yǎng)始于1933年Tukey對(duì)櫻桃的胚培養(yǎng)[4]，之后已成功的運(yùn)用于桃、杏、棗等果樹中，在果樹育種中極具優(yōu)勢(shì).‘李廣杏’是薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)杏屬(ArmeniacaMill)植物[5]，又名包仁杏，是甘肅敦煌的優(yōu)質(zhì)地方資源品種，以其果實(shí)外形規(guī)正，果大賽李，果皮金黃色，色澤油光鮮亮，皮薄肉多核小，味美汁多，香氣四溢等優(yōu)良性狀深受消費(fèi)者的喜愛(ài).但是，‘李廣杏’栽培種中存在嚴(yán)重的雌蕊敗育及晚霜危害等因素，使其常規(guī)雜交育種相對(duì)困難，進(jìn)程較為緩慢[6]，遠(yuǎn)緣雜交和轉(zhuǎn)基因育種為解決這一問(wèn)題提供了新途徑.本試驗(yàn)選取6-BA、IAA、IBA、ZT 4種植物激素，優(yōu)化和建立了‘李廣杏’幼胚培養(yǎng)體系，以期為‘李廣杏’遠(yuǎn)緣雜交和利用基因工程進(jìn)行品種改良奠定研究基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1材料采集

‘李廣杏’采自甘肅省農(nóng)科院杏品種園，取盛花后30～40 d的果實(shí)(圖1)，果肉較少，果核半木質(zhì)化，剝?nèi)ス夂?，砸開果核并小心的取出種子放入已消毒的三角瓶中，作為胚培養(yǎng)的材料.

圖1　杏盛花后30～40 d的果實(shí)

1.2培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L，pH6.0.幼胚萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：6-BA與ZT分別設(shè)0、0.5、1.0 mg/L 3個(gè)水平，IAA與IBA分別設(shè)0、0.2 mg/L 2個(gè)水平分別組合進(jìn)行試驗(yàn)，共10個(gè)處理，CK為不添加任何激素的處理.胚培苗的繼代增殖培養(yǎng)基為6-BA，設(shè)0.5、1.0 mg/L 2個(gè)水平，IAA設(shè)0、0.05、0.10 mg/L 3個(gè)水平進(jìn)行組合試驗(yàn)，共6個(gè)處理.

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃；光照強(qiáng)度為2 500～3 000 lx；光周期為16 h/8 h.

1.3幼胚培養(yǎng)方法

1.3.1幼胚材料的準(zhǔn)備接種前將種子在自來(lái)水下沖洗30 min，瀝干水分，在超凈工作臺(tái)上用70 %乙醇浸泡30 s，再用0.1% 升汞表面消毒7 min，最后用無(wú)菌水沖洗4～5次，用解剖針和手術(shù)刀切開種子，挑出種胚后接種到預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上.

1.3.2幼胚誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，接種后觀察培養(yǎng)過(guò)程中胚的發(fā)育狀況，分別記錄10、20、30 d時(shí)的萌發(fā)數(shù)及30 d后的胚培苗平均高度，計(jì)算萌發(fā)率.

萌發(fā)率(%)=萌發(fā)的胚數(shù)/接種的胚數(shù)×100%

1.3.3胚培苗的繼代增殖增殖培養(yǎng)時(shí)先將胚培苗在MS基本培養(yǎng)基上壯苗15 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)、苗高等指標(biāo)基本一致的胚培苗作為增殖培養(yǎng)的材料.每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接1個(gè)胚培苗.增殖培養(yǎng)后觀察其生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)各處理的出苗總數(shù)，計(jì)算增殖系數(shù)[7].

增殖系數(shù)=出苗總株數(shù)/接種株數(shù)

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件作LSD差異顯著性分析.

2結(jié)果與分析

2.1不同激素組合對(duì)‘李廣杏’幼胚萌發(fā)的影響

2.1.1不同濃度6-BA和IAA，IBA組合對(duì)幼胚萌發(fā)的影響由表1可知：6-BA和IAA，IBA不同配比處理對(duì)幼胚萌發(fā)與子葉生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用.單獨(dú)添加0.2 mg/L IAA或IBA，幼胚萌發(fā)率和接種30 d后胚培苗的平均株高均較低.由此看來(lái)，單獨(dú)使用一種生長(zhǎng)素時(shí)，胚萌發(fā)和子葉生長(zhǎng)情況不理想.在IAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，附加0.5 mg/L 6-BA，胚萌發(fā)快(圖2-A～C)，接種30 d時(shí)萌芽率達(dá)100%，且在此條件下，子葉生長(zhǎng)健壯，葉片濃綠，莖稈粗壯，長(zhǎng)勢(shì)良好(圖2-E)， 30 d時(shí)胚培苗平均株高為4.62 cm，顯著高于6-BA濃度為1.0 mg/L處理(P<0.05)和CK(P<0.05).在IBA濃度為0.2 mg/L時(shí)，附加1.0 mg/L 6-BA，接種30 d時(shí)胚培苗平均株高為4.34 cm，顯著高于6-BA濃度為0.5 mg/L處理(P<0.05)以及CK(P<0.05).從整體來(lái)看，A2處理下，接種30 d時(shí)胚培苗的平均株高(4.62 cm)顯著的高于其他處理，但與A6(4.34 cm)處理相比沒(méi)有顯著性差異.由于A6條件下，幼胚萌發(fā)較慢，萌發(fā)的子葉葉尖逐漸黃化壞死，葉片卷曲發(fā)黃，葉片玻璃化明顯，長(zhǎng)勢(shì)差(圖2-D)，因此并不適合花后30～40 d幼胚的萌發(fā).固幼胚萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基配比為MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L.

表1　不同濃度6-BA和IAA、IBA組合對(duì)幼胚萌發(fā)的影響

A～C：幼胚在A2處理下胚萌發(fā)動(dòng)態(tài)；D：幼胚在A6處理下胚培苗30 d時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)；E：幼胚在A2處理下胚培苗30 d時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)；F：幼胚在B5處理下胚培苗30 d時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài).

圖2不同天數(shù)胚的生長(zhǎng)情況

Fig.2The growth of the embryo after different days

2.1.2不同濃度ZT和IAA,IBA組合對(duì)幼胚萌發(fā)的影響表2所示：ZT和IAA，IBA不同配比處理下對(duì)幼胚萌發(fā)與子葉生長(zhǎng)有較明顯的影響，但效果沒(méi)有6-BA和IAA，IBA顯著.在IAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，附加0.5 mg/L或1.0 mg/L ZT，胚萌發(fā)率和胚培苗平均株高與單獨(dú)添加IAA相比反而降低，由此看來(lái)，IAA與ZT同時(shí)使用，并不適合幼胚的萌發(fā).單獨(dú)添加0.2 mg/L IBA，接種30 d時(shí)胚培苗平均株高為3.47 cm，與附加ZT 0.5 mg/L或1.0 mg/L的株高沒(méi)有顯著性關(guān)系，但附加ZT后明顯提高了胚萌發(fā)率.整體來(lái)看，附加ZT對(duì)胚萌發(fā)和子葉生長(zhǎng)并未起到明顯的促進(jìn)作用，如B5處理下(圖2-F)，接種30 d時(shí)的胚培苗，葉片卷曲且顏色較淡，長(zhǎng)勢(shì)差.因此，附加ZT對(duì)胚萌發(fā)和子葉生長(zhǎng)沒(méi)有顯著的改善作用.

綜合分析，6-BA與IAA或IBA同時(shí)使用優(yōu)于單獨(dú)添加IAA或IBA的處理，且6-BA與IAA同時(shí)使用效果顯著，而ZT與IAA或IBA同時(shí)使用時(shí)，幼胚萌發(fā)率和胚培苗平均株高不僅無(wú)提高反而有所降低.因此，適合李廣杏花后30～40 d幼胚萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基配比為MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L.

表2　不同濃度ZT和IAA，IBA組合對(duì)幼胚萌發(fā)的影響

LSD法檢測(cè)，小寫字母表示0.05水平上的顯著性.

2.2不同激素組合對(duì)胚苗繼代增殖的影響

由表3可見(jiàn)：當(dāng)IAA濃度相同，6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，胚培苗增殖系數(shù)均明顯大于6-BA濃度為0.5 mg/L的增殖系數(shù).當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L，IAA濃度為0.05 mg/L時(shí)，胚培苗的增殖系數(shù)為3.10，顯著大于IAA濃度為0 mg/L和0.1 mg/L時(shí)的增殖系數(shù)(P<0.05)；當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L，IAA濃度為0.05 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)為3.42，顯著大于IAA濃度為0 mg/L和0.1 mg/L時(shí)的增殖系數(shù)(P<0.05).總體來(lái)看，C5處理下的增殖系數(shù)(3.42)顯著大于其他處理(P<0.05)，且增殖苗生長(zhǎng)健壯，長(zhǎng)勢(shì)均一，葉片濃綠(圖3).因此,適合胚培苗繼代增殖的培養(yǎng)基配比為MS+6-BA 1.0 mg/L + IAA 0.05 mg/L.

表3　不同激素配比對(duì)胚苗繼代增殖的影響

LSD法檢測(cè)，小寫字母表示0.05水平上的顯著性.

3討論

一個(gè)正常植物胚胎發(fā)生過(guò)程是一個(gè)從合子進(jìn)行第1 次分裂開始至分生組織形成、幼胚建立的連續(xù)、漸進(jìn)的變化過(guò)程.在這個(gè)過(guò)程中,胚由只吸收營(yíng)養(yǎng)時(shí)期過(guò)渡到制造營(yíng)養(yǎng)時(shí)期[8].胚齡越小需要的培養(yǎng)基成分越復(fù)雜[9]，且胚齡小的比胚齡大的更難成活[10]，合適的激素種類和質(zhì)量濃度配比，是成功實(shí)現(xiàn)胚培養(yǎng)的重要因素[11].一般情況下，外植體類型不同，基因型不同，適宜選用的細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素的種類及濃度也有很大的差異[12-13]，如王發(fā)林等[14]的研究得出，李、杏屬間遠(yuǎn)緣雜交所得雜種胚在MS + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基上繼代增殖和生長(zhǎng)良好；Yang等[15]在體外胚培養(yǎng)葡萄二倍體與四倍體雜種胚的研究中得出，培養(yǎng)基中添加GA30.35 mg/L和IAA 1.75 mg/L，不僅有助于打破胚的休眠，而且利于胚的萌發(fā)和生長(zhǎng)；此外，王玉安[16]通過(guò)對(duì)桃胚培養(yǎng)的研究得出，桃胚在添加6-BA 1.0～2.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基上，獲得 93.8%以上的萌發(fā)率，最高可達(dá)到100%.本試驗(yàn)結(jié)果表明，李廣杏胚培養(yǎng)中，誘導(dǎo)胚萌發(fā)的適宜6-BA濃度為0.5 mg/L，適宜IAA濃度為0.2 mg/L，在此條件下，培養(yǎng)30 d時(shí)胚萌發(fā)率達(dá)100%，胚培苗的平均株高為4.62 cm，且胚培苗生長(zhǎng)健壯.由此說(shuō)明，在胚培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞分裂素濃度并不是越高越好.胚培苗的繼代增殖過(guò)程中，適宜IAA濃度為0.05 mg/L，適宜6-BA濃度為1.0 mg/L，該條件下胚培苗繼代增殖系數(shù)達(dá)3.42，顯著高于其他處理.在IAA濃度相同的條件下，1.0 mg/L 6-BA處理的增殖系數(shù)明顯大于0.5 mg/L處理下的.但是因?yàn)橹辉O(shè)定了IAA 0.5、1.0 mg/L 2個(gè)濃度梯度，所以不能說(shuō)明6-BA濃度1.0 mg/L就是胚培苗繼代培養(yǎng)的最佳濃度.

圖3　C5處理下30 d時(shí)的增殖狀態(tài)

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(責(zé)任編輯胡文忠)

收稿日期：2014-04-28；修回日期：2014-06-10

基金項(xiàng)目：甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(3ZS061-A25-078).

通信作者：陳佰鴻，男，教授，主要研究方向?yàn)楣麡渖砼c生物技術(shù).E-mail:bhch@gsau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S 662.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2015)02-0097-05