王 丹孟品佳陳琳琳（中國人民公安大學(xué) 北京 00000； 中國刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 0035）

三相中空纖維微萃取 -高效液相色譜檢測尿液中的海洛因代謝物

王 丹1孟品佳1陳琳琳2
（1中國人民公安大學(xué) 北京 100000；2 中國刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035）

建立了中空纖維液 -液 -液三相萃取模式 （3p-HF-LPME） -高效液相色譜 （HPLC）法測定尿中的海洛因代謝物嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因的方法。對高效液相色譜的檢測條件及影響液相微萃取的因素進行了考察和優(yōu)化。

中空纖維 液相微萃取 海洛因代謝物 高效液相色譜

我國的毒品問題依然復(fù)雜嚴峻。海洛因是其中最具代表性的毒品，據(jù)2014年《中國禁毒報告》，全國濫用海洛因人員 132.6萬名，同比上升 6.6%，占吸毒人員總數(shù)的53.6%。[1]海洛因體內(nèi)代謝的研究一直是分析中的重要內(nèi)容，對于禁毒工作具有重要意義。對于海洛因吸食者，其代謝物嗎啡、O6-單乙酰嗎啡以及可待因在檢測過程中是非常關(guān)鍵的目標物，但由于此類化合物的極性較大，具有親水性，很難用氣相色譜法直接進行檢測，色譜行為較差，檢測靈敏度偏低，通常需要進行衍生化處理[2]后用氣相色譜法檢測或用液相色譜法、毛細管電泳等儀器進行檢測。[3]

對于生物檢材中的海洛因，其樣品前處理方式主要是液相萃取，但液相萃取易于乳化，很難自動化，需要大量的有機溶劑，毒性較大，產(chǎn)生大量實驗室廢液，污染環(huán)境。Pedersen-Bjergaard[4]等人提出的中空纖維液相微萃取技術(shù)是將有機溶劑固定在中空纖維孔壁內(nèi)，生物樣品中的大分子雜質(zhì)難以通過纖維孔進入接收相，中空纖維對樣品溶液起到微孔過濾的作用，集萃取、過濾、富集于一體。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

日本日立高效液相色譜儀（HITACHI D-7000；檢測器：UV L-7420），HSM色譜工作站，色譜柱phenomenex C18反相色譜柱 （250×4.6mm，pH范圍2-10），DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪高科儀器廠），AccurelQ3/2聚丙烯中空纖維（Membrana，Wupperta，Germany，壁厚200μm，孔徑0.20μm，內(nèi)徑600μm）。

嗎啡鹽酸鹽、O6-單乙酰嗎啡鹽酸鹽、磷酸可待因標準品均購于公安部物證鑒定中心；甲醇、乙腈均為色譜純。磷酸、磷酸二氫鉀、三乙胺、甲苯、環(huán)己烷、異丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正辛醇和甲苯均為分析純；實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2 標準溶液配制

標準儲備溶液（1.0mg/mL）：用電子天平精密稱取鹽酸嗎啡1.13mg、O6-單乙酰嗎啡1.11mg、磷酸可待因 1.11mg分別溶于 lmL甲醇中，配成 1.0mg/mL的甲醇儲備液。標準工作液：分別準確量取上述1.0mg/mL的標準儲備液各10μL，加入pH2磷酸溶液定容至 1.0mL，配制成10.0μg/ml的混合標準工作液。

1.3 三相中空纖維液相微萃取操作方法

將健康空白尿液或海洛因吸食者尿液用 0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9，作為本實驗的樣品相。取10mL放入樣品瓶中，加入5×10mm微型磁力攪拌子。

取中空纖維將其剪切為5cm長，將其放入丙酮

中超聲5min，消除中空纖維中的可能雜質(zhì)。將處理過的中空纖維浸入辛醇溶劑中1min，取出，迅速用氣相色譜專用微量注射器吸取 20μLPH2磷酸 （接收相）注入中空纖維內(nèi)腔中，兩端用5mL一次性注射針頭固定形成U型模式（如圖1），插入樣品溶液中，將樣品瓶瓶蓋密封，放入恒溫磁力攪拌器中，調(diào)節(jié)溫度 30℃，磁力攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為 1000r/min，萃取 40min后，停止攪拌，用微量注射器在針頭一端抽回內(nèi)腔中接收相，直接注入到高效液相色譜中檢驗。

圖 1 中空纖維液相微萃取裝置

1.4 高效液相色譜檢測條件

色譜柱：phenomenex C18柱（250mm×4.6mm，pH范圍2-10），流動相條件：流動相A：20mmol/L磷酸二氫鉀+0.02mol/L三乙胺水溶液，用磷酸調(diào)pH=6.0；流動相 B∶乙腈，A、B均脫氣備用。流動相分配為 A∶B=90∶10。流動相流速為 1.0mL/min，紫外檢測波長為210nm，進樣量為10μL。

1.5 萃取回收率和富集倍數(shù)計算方法

目標分析物的富集倍數(shù)（enrichment factor，EF）和回收率 （R） 可依據(jù)以下公式計算，

na,final和ns,initial分別是分析 物萃取前在樣品 相中和萃取后在接收相中的摩爾濃度，Va為接收相的體積，Vs為樣品相的體積，Ca,final為分析物在接收相中的濃度，Ca,initial為分析物在樣品相中的最初濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 理論闡述

中空纖維三相微萃取體系包括三相：樣品相、有機相（中空纖維內(nèi)壁）、接收相，將中空纖維插入有機溶劑中，有機溶劑通過毛細力或注入方式進入到中空纖維內(nèi)膜中，然后將接受相 （水相） 注入中空纖維內(nèi)腔內(nèi)。在本研究中，尿中嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因萃取前調(diào)至堿性，使嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因呈有機態(tài)通過攪拌加速被萃取到有機相中，接收相將pH值調(diào)節(jié)為酸性，分析物在有機相與接受相界面上與接受相中的酸中和為離解狀態(tài)，被反萃進入接受相。接受相中的分析物可直接進樣到HPLC或CE進行檢測。

2.2 中空纖維液相萃取條件的選擇與優(yōu)化

樣品相為向健康人尿液中添加三種目標物的標準溶液，定容為10mL，令其中目標物濃度均為10mg/L，按照1.4的高效液相色譜檢測條件進行檢測。以目標物在萃取中所獲得的富集倍數(shù)作為其萃取效率的考察指標。

2．2．1 有機溶劑對萃取效果的影響

有機溶劑是影響萃取效果的重要因素。三相中空纖維微萃取對萃取溶劑的要求：一是與中空纖維有很好的兼容性，可以穩(wěn)定地存在于纖維的內(nèi)腔或壁孔中不能泄露；二是對目標分析物有合適的溶解度和選擇性，不易揮發(fā)，毒性小。[5]本實驗選擇甲苯、正辛醇、異丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、環(huán)己烷 6種有機溶劑作為萃取劑，按照1.3的萃取操作，對含10mg/L的三種目標化合物加標工作溶液進行檢測。結(jié)果見圖2。正辛醇作為有機相時，接收相體積穩(wěn)定，嗎啡、06-單乙酰嗎啡、可待因的富集倍數(shù)明顯高于其它溶劑。苯及其衍生物中僅甲苯對鴉片類毒品有一定萃取，但甲苯作為三相萃取溶劑，隨著萃取時間的增加，接收相流失嚴重。而烷烴類溶劑對3種目標分析物幾乎沒有萃取。乙酸乙酯對 3種目標化合物有一定的萃取作用，但乙酸乙酯沸點低，接收相也有一定的損失。乙酸丁酯與異丙醇的情況略好一些，對3種目標分析物均有一定的富集效果。我們實驗中的3種目標分析物，均具有一定的極性和親水性，正辛醇中的羥基（-OH）能與嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因結(jié)構(gòu)中（-OH）形成氫鍵，增加該類化合物在正辛醇中的溶解度。氫鍵可能是決定萃取效率的主要因素，與嗎啡等形成氫鍵能力越強的有機溶劑萃取效率越高，反之越低。本實驗選擇所考察溶劑中萃取效率最高的正辛醇作為萃取溶劑。

圖 2 有機溶劑對萃取效果的影響

2．2．2 樣品相和接收相pH值對萃取效果的影響

在3p-HF-LPME中，調(diào)節(jié)樣品相的pH值，改變目標分析物在樣品溶液中的存在形態(tài)，使其以化合物原體形態(tài)被有機溶劑萃取，而調(diào)節(jié)接收相的pH值，使分析物呈離解狀態(tài)，即能使分析物迅速從有機溶劑中反萃出來，又能夠防止其重新擴散回有機溶劑中。因此 pH可以改變酸性或堿性目標分析物在樣品溶液中存在的形態(tài)，從而影響化合物在樣品相、有機相與接收相三相之間分配平衡系數(shù)，從而影響萃取效率 。[6]

實驗中用 0.1mol/LNaOH調(diào)節(jié)樣品相，令其 pH分別為 8、9、10、11、12，按照 1.3的方法操作，接收相為磷酸（pH=2），萃取后，取接收相直接進入HPLC分析。結(jié)果如圖3所示，嗎啡在pH=9時萃取效率最高，之后隨著 pH值的增高而下降。O6-單乙酰嗎啡與可待因的富集倍數(shù)隨著pH的增高而增大，當(dāng)pH為11之后變化不明顯。綜合考慮，結(jié)合嗎啡的情況，實驗樣品相pH選擇調(diào)節(jié)為9。

圖3 樣品相pH對萃取效果的影響

圖 4 接收相對萃取效果的影響

對于3p-HF-LPME，接收相的pH不但要能夠使目標分析物呈離解狀態(tài)，完全從有機溶劑中反萃出來，還能滿足后續(xù)儀器分析的直接進樣的要求。檢測堿性化合物常用的酸主要有鹽酸、磷酸、甲酸等。本實驗中充分考慮到后續(xù)用HPLC做為分析儀器時，鹽酸中的氯離子對色譜柱的影響很大，能夠加速其 C18色譜柱的退化。本實驗選擇磷酸作為接收相介質(zhì)。用pH計調(diào)節(jié)配制不同pH值的磷酸溶液，按照1.3的方法操作，萃取劑為正辛醇，接收相為 pH為 1.0、2.0、3.0的磷酸，萃取后，取接收相直接進入 HPLC分析。結(jié)果表明見圖4，pH1.0時的富集效率最大，隨pH增大，富集效率下降，但綜合考慮pH過大對色譜柱造 成 影 響 ， 最 終 選 擇 pH2.0的 接 受 相 進 行3p-HF-LPME。

2．2．3 萃取時間對萃取效果的影響

取樣品相按1.3的萃取操作,考察萃取時間分別為10、20、30、40、50、60min時對富集效率的影響，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，隨著萃取時間的增加，富集倍數(shù)增加，這是由萃取平衡決定的，但對于3p-HF-LPME，萃取時間不宜過長，接受相會隨著攪拌流失，也會導(dǎo)致其與有機溶劑互溶，富集倍數(shù)降低。實驗表明萃取 40min可以獲得較好的回收率與富集倍數(shù)。

圖 5 萃取時間對萃取效果的影響

圖 6 攪拌速度對萃取效果的影響

2．2．4 攪拌速度對萃取效果的影響

提高攪拌速度可以促進分析物在 3p-HF-LPME之間的傳質(zhì)。本實驗按1.3的萃取操作，考察了攪拌速度分別為400、600、800、1000、1200r/min時富集倍數(shù)的情況，結(jié)果（圖6）表明，當(dāng)轉(zhuǎn)速為1000 r/min時，萃取效果最好。若繼續(xù)增大轉(zhuǎn)速，可能導(dǎo)致：（1）正辛醇有機膜被破壞，萃取效率降低；（2）尿液可能會發(fā)生乳化現(xiàn)象。因此，本試驗選擇1000 r/min作為攪拌速度。

2.3 優(yōu)化條件下的加標尿樣色譜行為

本實驗在優(yōu)化的液相色譜條件和液-液-液中空纖維萃取條件下，分別直接將空白尿液經(jīng)過0.45μm濾膜過濾后直接進樣分析；空白尿液經(jīng)過3P-HF-LPME后進樣；3種目標分析物的濃度為500μg/L的混合標準溶液直接進樣；樣品相3個目標分析物的濃度為500μg/L混合標準工作的加標尿樣經(jīng)過 3P-HF-LPME后進入 HPLC進行分析。結(jié)果見圖7、8、9、10。

圖7顯示尿樣中的組成復(fù)雜，干擾物質(zhì)多，必須經(jīng)過萃取除去雜質(zhì)；圖8顯示空白尿樣進行3p-HF-LPME后色譜峰干凈，表明尿液中的大分子物質(zhì)、蛋白質(zhì)等干擾成分已經(jīng)被中空纖維膜隔離，沒有進入接收相，表明中空纖維膜能有效的阻止復(fù)雜樣品基質(zhì)中的干擾物。圖9與圖10相比，通過液相色譜峰的峰高（H），能夠看出，通過 3p-HF-LPME，3個目標分析物的峰高顯著增高，說明該萃取模式能夠?qū)δ繕朔治鑫镞M行顯著的富集。結(jié)果表明，中空纖維液相微萃取方法具有非常好的凈化與富集能力。

圖7 空白尿樣直接分析色譜圖

圖8 空白尿樣經(jīng)3p-HF-LPME后色譜圖

圖9 濃度為500μg/L萃取后的混合標準溶液的加標尿樣直接分析色譜圖；1-嗎啡，2-可待因，3-O6-單乙酰嗎啡

圖10 目標分析物的濃度為500μg/L經(jīng)過3p-HF-LPME后色譜圖；1-嗎啡，2-可待因，3-O6-單乙酰嗎啡

2.4 富集倍數(shù)與回收率

取預(yù)先調(diào)好pH為9的健康人尿液，添加混合標準工作液，定容為10mL，分別配制3種目標分析物的濃度分別為 50μg/L、200μg/L、500μg/L的樣品相，在優(yōu)化的高效液相色譜條件與 3p-HF-LPME萃取條件下，按1.3的萃取操作進行，直接進行HPLC分析，每個樣品平行萃取5次。目標物的峰高響應(yīng)值與 50μg/L、200μg/L、500μg/L標準工作溶液的峰高響應(yīng)值比較，按照1.5的計算公式，得到富集倍數(shù)。

在回收率計算中，其中樣品相體積Vs固定為10mL，接收相體積按照 1cm內(nèi)腔為 600μm聚丙烯中空纖維的體積約為2.6μL（一般情況下長度為1cm，壁厚為200μm，內(nèi)徑為600μm，壁孔為0.2μm的中空纖維可固載體積為8μL的有機溶劑，內(nèi)腔內(nèi)可容納 2.6μL的 溶劑[5]）， 則 本 實 驗 的 接收 相 體 積 為13μL，樣品相體積10mL，按照1.5的計算公式，得到目標分析物的萃取回收率。結(jié)果見表1。

表 1 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因富集倍數(shù)與回收率計算結(jié)果

2.5 工作曲線制備、檢測限、相對標準偏差

向pH為9的尿液中添加混合工作液，稀釋配制濃度分別為 10μg/L，20μg/L，50μg/L，100μg/L，500μg/L不同濃度的標準溶液，在優(yōu)化的萃取條件下，按1.4色譜條件檢測，繪制工作曲線，計算相關(guān)系數(shù)，以3倍信噪比計算最低檢測限。檢測結(jié)果見表2。

表 2 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因標準工作曲線

2.6 吸毒嫌疑人尿液的檢測

在優(yōu)化的萃取條件和高效液相色譜條件下，取某地的吸食海洛因嫌疑人的送檢的尿液進行了萃取和測定，經(jīng)計算，該嫌疑人尿液中嗎啡、O6-單乙酰嗎啡及可待因濃度為4.7、3.8、0.23mg/L。檢測結(jié)果表明該嫌疑人吸食毒品海洛因。

[1]中國國家禁毒委員會，2015年中國禁毒報告，2015年3月．

[2]王國建，李敏剛，馬治平等，SPME結(jié)合衍生化檢測尿液中嗎啡成份[J]，刑事技術(shù)，2004:34-35．

[3]劉慶艷，羅芳苜，尿液中違禁藥物的載體促進傳遞液相微萃取—高效液相色譜法測定[J]，分析測試學(xué)報，2009年（5）：23-26．

[4] Pedersen-Bjergaard S,Rasmussen Knut Einar．Liquid-phase microextraction w ith porous hollow fibers,a miniaturized and highly flexible format for liquid liquid extraction [J]．Journal of Chromatography A,2008,1184: 132-142．

[5]朱穎，陳璇，鄭飛浪，白小紅．三相中空纖維液相微萃取在羥基苯甲酸類化合物分析中的應(yīng)用[J]，色譜，2009，27：56-60．

[6]Ho T S,Reubsaet J L E,Anthonsen H S, Pedersen-Bjergaard S,Rasmussen K E J．Liquid-phase microextraction based on carriermediated transportcombined w ith liquid chromatographymassspectrometry:new concept for thedetermination ofpolardrugsin asingledrop ofhuman plasma[J]．Chromatogr．A,2005,1072（1）29-36．

（責(zé)任編輯：于 萍）

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2095-7939(2015)03-0074-04

2015-04-07

王丹 （1978-），遼寧葫蘆島人，中國刑警學(xué)院禁毒學(xué)系副教授，中國人民公安大學(xué)在讀博士生，主要從事禁毒學(xué)、毒品合成與檢驗方面的研究。