李繼民 許英?。ㄖ袊?guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035）

AEC柱前衍生化法鑒別紙張的研究

李繼民 許英健
（中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035）

建立 3-氨基 -9-乙基咔唑柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定紙張水解液中單糖含量的方法。以3-氨基-9-乙基咔唑?yàn)橹把苌噭?，Thermo C18色譜柱為分離柱，乙腈和乙酸銨水溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為 245nm處，用高效液相色譜分析紙張中的單糖含量。該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，為不同品牌紙張的鑒別提供了一種實(shí)用的方法。

3-氨基-9-乙基咔唑 單糖 紙張 高效液相色譜法

纖維素和半纖維素是紙張的主要成分，二者均為多糖，水解后可得到葡萄糖和木糖。單糖的測(cè)定方法主要有 TLC法[1]、分光光度法[2]、HPLC法[3]、GC法等[4]。單糖分子本身沒有足夠的揮發(fā)性和分子，結(jié)構(gòu)中也沒有生色基團(tuán)，因此必須先進(jìn)行柱前衍生化，再進(jìn)行氣相、液相色譜分析[5、6]。采用3-氨基-9-乙基咔唑（AEC） 為柱前衍生化試劑[7、8]，對(duì)多糖進(jìn)行分離，測(cè)定了不同品牌紙張中葡萄糖、木糖的含量，結(jié)果定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為紙張種類鑒別提供了一種簡(jiǎn)單適用的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：D-7000型高效液相色譜儀（日立公司）；色譜柱 （Thermo C18）；電子天平 （梅特勒托利多）；電子恒溫水浴鍋（深圳國(guó)華）；80型離心機(jī)（上海手木器械廠）。

試劑：3-氨基-9-乙基咔唑（西亞試劑）；氰基硼氫化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；葡萄糖（沈陽(yáng)市試劑一廠，分析純）；乙腈、甲醇為色譜純；乙酸銨、無(wú)水乙醇等均為分析純，試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

樣品：10種不同品牌的紙張樣品，見表 2。

1.2 色譜條件

流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.01mol/L醋酸銨緩沖溶液 （PH=4.5），A∶B=16∶84；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量 10μL；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：245nm。

1.3 溶液的配制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：用電子天平準(zhǔn)確稱取干燥的葡萄糖10.0000g，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,用水加到刻度線，混合均勻后，備用。

木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：用電子天平準(zhǔn)確稱取干燥的木糖1.0000g，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用水加到刻度線，混合均勻后，備用。

衍生化試劑：用電子天平準(zhǔn)確稱取3-氨基-9-乙基咔唑 1.0000克，用甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至 100mL容量瓶中，用甲醇加到刻度線，混合均勻后，備用。

氰基硼氫化鈉溶液的配制：用電子天平準(zhǔn)確稱取氰基硼氫化鈉0.5000克，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用水加到刻度線，混合均勻后，備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

用移液管分別移取0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液置于 100mL容量瓶中，定容，搖勻配制成葡萄糖濃度為：0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，混合均勻后備用。

用移液管分別移取 0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0m L、5.0mL、6.0mL木糖標(biāo)準(zhǔn)液置于100mL容量瓶中，定容，搖勻配制成木糖濃度為：0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60mg/mL的木糖標(biāo)準(zhǔn)液，混合均勻備用。

1.5 加標(biāo)回收率的測(cè)定

用移液管分別移取葡萄糖、木糖標(biāo)準(zhǔn)液1.0mL，轉(zhuǎn)移到 100mL容量瓶中，共配置 10份，1～5號(hào)分別加入葡萄糖2.000mg，6～10號(hào)作為空白樣品，1～10號(hào)加水至容量瓶刻度線，混合均勻后備用。

1.6 復(fù)印紙樣品中葡萄糖含量的測(cè)定

用移液管移取樣品溶液 0.50mL，加到 10mL試管中，加入0.50mL AEC的甲醇溶液，依次加入0.30mL的氰基硼氫化鈉水溶液，最后加入40μL冰醋酸。用封口膜封口后放入70℃水浴中，反應(yīng)70min后冷卻至室溫。然后加入 0.5mL水，加入 1.5mL氯仿溶解，渦旋 3min后，離心分離 5min，除去有機(jī)相，重復(fù)3次。樣品用水稀釋定容至5mL，進(jìn)行高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 紙張樣品中單糖的定性分析

單糖的苷健在酸性條件下與3-氨基-9-乙基咔唑的伯胺反應(yīng)生成烯胺，然后在氰基硼氫化鈉的還原作用下，生成穩(wěn)定的二級(jí)胺，從而使單糖被AEC所標(biāo)記，提高了單糖檢測(cè)的靈敏度。

葡萄糖、木糖混合標(biāo)準(zhǔn)品和紙張樣品水解液的AEC柱前衍生物的高效液相色譜圖，見圖。葡萄糖的保留時(shí)間為16.18min，木糖的保留時(shí)間為19.44min。

圖 單糖、紙張水解液樣品柱前衍生化高效液相色譜圖

葡萄糖、木糖的 AEC衍生物在確定的色譜條件下得到了很好的分離，色譜峰對(duì)稱無(wú)拖尾，說(shuō)明AEC與中性糖可發(fā)生衍生化反應(yīng)，無(wú)副產(chǎn)物，有較高的反應(yīng)活性。中性糖在紫外檢測(cè)（245nm）下的分離結(jié)果，可以看出衍產(chǎn)物在紫外檢測(cè)器下，有較高的檢測(cè)向應(yīng)。

2.2 紙張樣品中單糖的定量分析

2．2．1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為系列葡萄糖濃度，縱坐標(biāo)為葡萄糖衍生物的色譜峰面積，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線為 A=3000000m-631623,相關(guān)系數(shù)r=0.9994，線性范圍為0.5～5.0mg/mL，最低檢測(cè)濃度為5.54μg/mL（3倍信噪比計(jì)算）。

2．2．2 木糖的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為系列木糖濃度，縱坐標(biāo)為木糖衍生物的色譜峰面積，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=5000000m-131215,相關(guān)系數(shù) r=0.9998，線性范圍為 0.05～0.60mg/mL，最低檢測(cè)濃度為2.77μg/mL（3倍信噪比計(jì)算）。

2．2．3 回收率和精密度

方法的回收率和精密度采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行評(píng)價(jià)，按照 1.5步驟進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度分析。樣品液中分別加入2.000mg葡萄糖，按1.6步驟進(jìn)行分析，重復(fù)測(cè)定5次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列入表1中。

表1 方法回收率和精密度測(cè)定結(jié)果（n=5）

2．2．4 紙張樣品中單糖含量的測(cè)定

10種不同品牌紙張樣品水解液按照1.6步驟進(jìn)行測(cè)定 3次，紙張樣品水解液中葡萄糖、木糖含量列于表2中。

從表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同品牌復(fù)印紙、不同標(biāo)號(hào)書寫紙中葡萄糖、木糖的含量存在明顯差異，可以采用此種方法進(jìn)行鑒別。

2．2．5 復(fù)印紙樣品自身均勻性檢驗(yàn)

為了排除紙張自身均勻性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，我們選取了不同廠家生產(chǎn)的不同牌號(hào)復(fù)印紙樣品中的1＃樣品，然后在同一張紙樣品上取7個(gè)不同的部位，按照上述方法進(jìn)行水解、還原、衍生化氣相色譜分析。同一張復(fù)印紙樣品中葡萄糖的含量為587.9、586.4、588.2、587.3、588.1、586.2、585.4mg/g，平均值587.1mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.08%；木糖的含量為45.7、47.2、46.1、44.8、45.1、45.8、46.2mg/g，平均值45.8mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.78%。

除了考查同一張紙樣品本身的不均勻性對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響外，我們考查了同一包紙紙樣的不均勻性對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。選取了1＃復(fù)印紙樣品，從同一包紙中隨機(jī)抽取7張復(fù)印紙樣品，按照上述方法進(jìn)行水解、還原、衍生化氣相色譜分析。同一包復(fù)印紙樣品中葡萄糖的含量為 588.1、587.5、585.8、588.2、587.6、588.2、586.3mg/g，平均值587.4mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.97%；木糖的含量為 44.9、45.2、47.1、45.4、46.5、45.2、44.9mg/g，平均值 45.6mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.86%。

表2 10種紙張樣品中葡萄糖、木糖的含量

3 結(jié)論

本文采用3-氨基-9-乙基咔唑柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定了紙張水溶液中的葡萄糖和木糖含量，達(dá)到了鑒別不同品牌紙張的目的，為利用紙張中葡萄糖、木糖含量鑒別紙張?zhí)峁┝艘环N實(shí)用的方法。

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（責(zé)任編輯：于 萍）

DF794．2

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2095-7939(2015)03-0078-03

2015-04-24

公安部應(yīng)用創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目 （編號(hào)：2012YYCXXJXY130）。

李繼民（1970-），男，吉林永吉人，中國(guó)刑警學(xué)院法化學(xué)系副教授，碩士，主要從事微量物證檢驗(yàn)研究。