王冬，周健鵬，王晨（1.國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300060；.天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070）

甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物作為一種新型的丙烯酸樹脂，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、無毒、無刺激性、不被人體吸收等諸多優(yōu)點(diǎn)[1-2]，可廣泛用于藥物制劑領(lǐng)域，作為緩、控釋制劑的包衣材料[3-6]。其有關(guān)物質(zhì)主要為甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的單體成分。為有效控制甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物的質(zhì)量，本試驗(yàn)建立了以高效液相色譜（HPLC）法測定其中甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯兩種單體成分含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括G1314A可變波長檢測器（VWD）、ChemStation色譜工作站等（美國Agilent公司）；e2695型HPLC儀，包括2489可變波長檢測器、Empower色譜工作站等（美國Waters公司）；CP225D型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

甲基丙烯酸對照品（批號：190011-120801）、丙烯酸乙酯對照品（批號：190018-120921）、3批甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物樣品（批號：20111204、20111205、20111206）及1批甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物仿制品均由天津某制藥公司提供；試劑均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（取含十二個結(jié)晶水的磷酸氫二鈉8.953 g、磷酸二氫鉀3.400 g，加水溶解并稀釋至1000 ml，用稀磷酸調(diào)pH至2.0）（30∶70，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：202 nm；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：20 μl[7-8]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯對照品各約10 mg，置于同一100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取10 ml，置于100 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取50 ml，精密加入水25 ml，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液10 ml，置于50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品約2 g，置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取50 ml，精密加水25 ml，搖勻，即得。

2.2.3 空白對照溶液 精密量取50 ml甲醇置于100 ml量瓶中，精密加水25 ml，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下的空白對照溶液、對照品溶液和供試品溶液各適量，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可見，甲基丙烯酸峰與丙烯酸乙酯峰在該色譜條件下可有效分離，分離度大于1.5；理論板數(shù)按甲基丙烯酸峰計(jì)算不低于1000；空白對照不干擾樣品中有關(guān)物質(zhì)的測定。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對照品貯備液1、2、4、6、8、10、15 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇-水（2∶1，V/V）稀釋制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.010%、0.015%的系列溶液。分別精密量取20 μl，注入HPLC儀，記錄色譜，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸，得甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的回歸方程分別為y＝127 790x－19.98 和y＝102 548x+18 975（r＝0.999 4、0.999 1）。結(jié)果表明，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在0.001%～0.015%范圍內(nèi)均與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 檢測限和定量限

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對照品貯備液適量，采取逐步稀釋法測定，按照信噪比為3計(jì)算，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯檢測限均為0.1 μg/ml；按照信噪比10計(jì)算，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯定量限均為0.3 μg/ml。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯峰面積的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7.1 對照品溶液 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，于室溫放置0、2、4、8、25 h時分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，甲基丙烯酸的峰面積分別為172 425、173 297、172 911、172 600、173 103，丙烯酸乙酯的峰面積分別為157 644、157 124、156 708、153 313、153 698，RSD分別為0.2%和1.3%，表明對照品溶液在25 h內(nèi)質(zhì)量基本穩(wěn)定。

2.7.2 供試品溶液 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（批號：20111205），精密量取適量，于室溫放置0、2、4、8、22 h時分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，甲基丙烯酸的峰面積分別為12 110、12 087、12 165、12 125、11 970，RSD為0.6%，丙烯酸乙酯均未檢出，表明供試品溶液在22 h內(nèi)質(zhì)量基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（批號：20111206），共6份，分別精密量取20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯含量。結(jié)果，甲基丙烯酸含量均為0.001%，丙烯酸乙酯均未檢出，兩者RSD均＜2%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號：20111204）約2 g，精密稱定，共9份，分別置于9個100 ml量瓶中，各精密加入“2.2.1”項(xiàng)下對照品貯備液4、4、4、5、5、5、6、6、6 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯含量，結(jié)果詳見表1。

2.10 耐用性試驗(yàn)

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

采用不同的廠家的儀器和色譜柱進(jìn)行耐用性試驗(yàn)，條件1：Waters e2695型HPLC儀，Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；條件2：Agilent 1100型HPLC儀，Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。結(jié)果，本方法的耐用性良好，詳見表2。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of durability test（n＝3）

2.1 1 樣品中有關(guān)物質(zhì)含量測定

分別取3批樣品及1批仿制品各適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備對照品溶液和供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的含量，結(jié)果詳見表3。

表3 樣品中有關(guān)物質(zhì)含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of contents determination of related substances in samples（n＝3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物是一種新型腸溶水性包衣材料，目前國內(nèi)外均未見到其有關(guān)物質(zhì)含量檢測的報(bào)道。因此，在其檢測波長的選擇上筆者參考了2010年版《中國藥典》（二部）聚甲丙烯酸銨酯Ⅱ中有關(guān)物質(zhì)檢查所用的波長，最終選定202 nm作為本品有關(guān)物質(zhì)檢測的波長。

3.2 流動相pH的選擇

由于本品的有關(guān)物質(zhì)檢測中涉及的組分呈酸性，因此流動相的pH對分離效果影響較明顯。本試驗(yàn)將緩沖液pH用稀磷酸分別調(diào)制至2.0、3.0、4.0，結(jié)果pH為2.0時分離效果最佳。

3.3 雜質(zhì)限度的確定

2010年版《中國藥典》（二部）聚甲丙烯酸銨酯Ⅱ有關(guān)物質(zhì)檢測項(xiàng)下提及的雜質(zhì)為甲基丙烯酸、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯，要求總雜質(zhì)不得過0.3%。本研究中3批樣品及1批仿制品的有關(guān)物質(zhì)含量測定結(jié)果顯示，單個雜質(zhì)均小于0.005%，總雜質(zhì)均小于0.01%。故初步擬定本品有關(guān)物質(zhì)限度為：單個雜質(zhì)不得大于0.005%，總雜質(zhì)不得過0.01%。

3.4 回收率的影響因素

本研究中，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的平均加樣回收率不高，分別為86.59%和91.24%。究其原因可能是由于：首先檢測波長為202 nm，屬于末端紫外吸收，氧氣對測定干擾較大；其次兩者的定量限均為0.3 μg/ml，樣品中單體雜質(zhì)含量很低。但兩者平均加樣回收率均大于80%，仍符合雜質(zhì)檢測回收率的有關(guān)要求。

綜上所述，本方法簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物中有關(guān)物質(zhì)的含量測定，并可為該輔料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明，該共聚物性質(zhì)穩(wěn)定，聚合率高，有關(guān)物質(zhì)符合規(guī)定。

[1]袁艷波，張文云.牙科生物材料細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法的研究進(jìn)展[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2009，26（3）：688.

[2]胡連棟，賈慧卿.口服藥物掩味方法的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2007，18（7）：552.

[3]任國蓮，張淑秋.口服結(jié)腸定位給藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].中國藥物與臨床，2006，6（1）：8.

[4]尹進(jìn)朝，李進(jìn)，高永良.中藥腸溶制劑研究進(jìn)展[J].中成藥，2011，33（2）：315.

[5]歐洋，陳幼芳，邵奇，等.中藥活性組分緩控釋制劑的研究進(jìn)展[J].浙江中醫(yī)雜志，2009，44（11）：845.

[6]姜玲，羅興洪，姜燕，等.中藥微丸的研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13（8）：94.

[7]何濤，張莉，賈曉航，等.索氏提取-反相高效液相色譜法測定人工晶狀體中甲基丙烯酸甲酯單體殘留量[J].理化檢驗(yàn)化學(xué)分冊，2011，47（11）：1 256.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1 249.