王夢(mèng)旻，陶智，楊志紅，呂卉芳

（湖北省武漢市黃陂區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430300）

·論著·

α-硫辛酸對(duì)腦缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用及可能機(jī)制研究

王夢(mèng)旻，陶智，楊志紅，呂卉芳

（湖北省武漢市黃陂區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430300）

目的觀察α-硫辛酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注的保護(hù)作用，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。方法將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組20只，采用線栓法制備缺血再灌注模型，實(shí)驗(yàn)組于灌注前30 min腹腔注射α-硫辛酸20 mg/kg，假手術(shù)組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。觀察并比較兩組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、心肌損傷標(biāo)志物和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)、NF-κB、TNF-α及Caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于模型組（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組大鼠cTnⅠ、MDA及GSH-Px含量顯著低于模型組，SOD含量顯著高于模型組（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組大鼠NF-κB、TNF-α和Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著低于模型組（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論α-硫辛酸可改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損，降低腦缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平，提高腦細(xì)胞抗氧化能力，同時(shí)抑制Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡，從多途徑發(fā)揮腦缺血再灌注保護(hù)作用。

缺血再灌注；α-硫辛酸；cTnⅠ；MDA；GSH-Px；SOD；NF-κB；TNF-α；Caspase-3

缺血再灌注損傷是指在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流供應(yīng)后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象[1]。氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)是造成神經(jīng)功能缺損的重要原因，NF-κB是核心環(huán)節(jié)[2]。此外，Caspase-3作為細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因子，在缺血再灌注損傷中起著重要作用[3]。本文通過(guò)線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，旨在研究α-硫辛酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注的保護(hù)作用，初步探討其作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年SD大鼠60只。雌雄各半；體重220～250 g；購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

α-硫辛酸購(gòu)自上海現(xiàn)代制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20045444。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

1.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京基蛋生物科技有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)試盒及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Caspase-3一抗（Santa cruz公司，美國(guó)），山羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)儀器酶標(biāo)儀（Bio-RAD公司），電熱恒溫水浴箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司），漩渦混勻器（蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），電泳儀（Life Technologies公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組各20只。實(shí)驗(yàn)組于灌注前30 min腹腔注射α-硫辛酸20 mg/kg，假手術(shù)組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4.2 大鼠缺血再灌注模型建立[4]大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，75%乙醇消毒頸部皮膚，沿頸部正中切開(kāi)，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，在頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈分支。采用手術(shù)線結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎并切斷左側(cè)頸外動(dòng)脈，下拉近心端，與左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈呈直線。將尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈達(dá)大腦中動(dòng)脈，栓線的血管外部分結(jié)扎固定。阻斷血流90 min后拔除栓線，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組結(jié)扎動(dòng)脈但不插入栓線，其余操作同模型組。再灌后16 h處死大鼠檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分參照Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定神經(jīng)功能。0分：無(wú)神經(jīng)損傷；1分：左前肢伸展障礙；2分：向左打圈；3分：行走時(shí)向左側(cè)傾倒；4分：意識(shí)昏迷；5分：死亡。

1.5.2 心肌損傷標(biāo)志物和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)取心臟組織進(jìn)行如下檢測(cè)免疫熒光定量法檢測(cè)cTnⅠ含量，硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性，比色法檢測(cè)GSH-Px活性。

1.5.3 TNF-α檢測(cè)取大鼠缺血腦組織采用免疫組化法檢測(cè)TNF-α含量。斷頭法處死大鼠，4%多聚甲醛固定后以視交叉前緣作2 mm厚冠狀位切片，脫水、透明、石蠟包埋，作4μm厚腦組織冠狀切片。石蠟切片脫蠟水化后滴加TNF-α一抗4℃過(guò)夜孵育，PBS沖洗3次，5 min/次。滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次。滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次。DAB顯色劑顯色15 min，蘇木素復(fù)染，免疫組化的定量分析采用灰度值分析。

1.5.4 NF-κB和Caspase-3檢測(cè)取大鼠缺血腦組織采用Western blot法檢測(cè)NF-κB和Caspase-3蛋白表達(dá)。斷頭法處死大鼠取腦組織，迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，洗去表面血跡。取缺血側(cè)大鼠腦組織，剪碎成2 mm×2 mm的小塊，置入勻漿器中勻碎。將勻漿液移至離心管中加入裂解液裂解10 min，4℃下13 000 r/min離心10 min，取上清液用于檢測(cè)。按照Bradford法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白含量，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，分離膠電泳電壓80 V，濃縮膠電泳電壓100 V；轉(zhuǎn)膜電壓設(shè)置為90 V，120 min。5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，—抗按照1∶500稀釋后與膜4℃雜交過(guò)夜，二抗按照1∶2 000稀釋后與膜雜交90 min。孵育結(jié)束，TBST洗3次，每次15 min，加入顯影液暗室壓片后曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)或F檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分不斷增高，表明再灌注加劇神經(jīng)功能損傷。各時(shí)間點(diǎn)比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于模型組（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明α-硫辛酸對(duì)再灌注后的神經(jīng)損傷具有一定的保護(hù)作用。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較（n=20，分±s）

表1 各組大鼠缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較（n=20，分±s）

注：覮與模型組比較，P<0.05

?

2.2 各組大鼠血漿指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較

模型組大鼠心肌梗死標(biāo)志物cTnⅠ和氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH-Px含量顯著升高，SOD活性顯著降低，與假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明心肌損傷和梗死同時(shí)存在，自由基損傷作用和抗氧化機(jī)制啟動(dòng)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠cTnⅠ、MDA及GSH-Px明顯降低，SOD明顯增高（P< 0.05），表明α-硫辛酸對(duì)缺血再灌注誘發(fā)的氧化應(yīng)激有明顯的抑制作用。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血漿指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

表2 各組大鼠血漿指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05

組別cTnⅠ/（μg/L）GSH-Px/（u/L）假手術(shù)組2.55±0.453.15±0.26227.43±16.72679.82±36.70模型組8.37±2.361）8.38±2.381）148.33±12.941）887.35±48.971）實(shí)驗(yàn)組5.47±10.371）2）5.32±1.411）2）183.83±9.731）2）739.33±315.091）2）F值66.42553.659173.868137.694 P值0.000.000.000.00 MAD/（nmol/L）SOD/（u/L）

2.3 各組大鼠TNF-α檢測(cè)結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TNF-α蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠TNF-α蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明α-硫辛酸可能通過(guò)抑制TNF-α表達(dá)從而抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)。見(jiàn)附圖及表3。

附圖 各組大鼠TNF-α檢測(cè)結(jié)果比較

表3 各組大鼠TNF-α檢測(cè)結(jié)果（±s）

表3 各組大鼠TNF-α檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05

組別TNF-α假手術(shù)組32.91±6.31模型組46.89±7.041）實(shí)驗(yàn)組40.87±7.361）2）F值20.554 P值0.00

2.4 各組大鼠NF-κB和Caspase-3檢測(cè)結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠NF-κB和Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠NF-κB和Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明NF-κB和Caspase-3在缺血后遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中具有重要作用。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠NF-κB和Caspase-3蛋白表達(dá)量比較（±s）

表4 各組大鼠NF-κB和Caspase-3蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05

組別Caspase-3NF-κB假手術(shù)組1.20±0.141.29±0.33模型組3.74±0.891）3.26±0.911）實(shí)驗(yàn)組2.68±0.641）2）2.29±0.711）2）F值79.96140.398 P值0.000.00

3 討論

隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步和生活方式的逐步改變，腦中風(fēng)發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈日益增長(zhǎng)的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。其中，缺血性腦中風(fēng)是血栓形成或動(dòng)脈栓子造成腦動(dòng)脈的阻塞，進(jìn)而造成局灶性腦缺血[4]。臨床治療缺血性腦中風(fēng)以盡早恢復(fù)血流灌注為原則，但是，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，缺血后血流恢復(fù)會(huì)進(jìn)一步加劇組織損傷和功能障礙，造成缺血再灌注損傷[5]。

α-硫辛酸是硫醇類(lèi)化合物，兼具脂溶性和水溶性，口服和靜脈給藥均能良好吸收，可透過(guò)血腦屏障[6]。α-硫辛酸具有很強(qiáng)的抗氧化能力，是人體必不可少的抗氧化劑。研究顯示α-硫辛酸作用廣泛，可清除多種活性氧、螯合金屬離子、抗細(xì)胞凋亡及抗炎癥反應(yīng)等，臨床主要用于治療糖尿病周?chē)窠?jīng)病變[7]。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明α-硫辛酸預(yù)處理對(duì)多種組織器官缺血再灌注具有保護(hù)作用，如腎臟、心肌、肝臟和睪丸[8]。

氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)是缺血再灌注的重要機(jī)制。再灌注可導(dǎo)致自由基過(guò)度生成，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)和核酸過(guò)氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。此外，炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)參與缺血再灌注損傷的全過(guò)程，加重腦組織損傷，炎性細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等，炎性因子包括IL-1、IL-8和TNF-α等。NF-κB幾乎存在于所有細(xì)胞內(nèi)，是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫反應(yīng)等過(guò)程。缺血再灌注損傷后釋放的上游炎癥因子，在IkBs激酶催化作用下IKB發(fā)生磷酸化，促使NF-κB激活進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因結(jié)合，從而釋放下游相關(guān)因子（如IL-1β和TNF-α），誘發(fā)炎癥反應(yīng)，造成惡性循環(huán)[10]。細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)受基因調(diào)控，其中Caspase-3是下游關(guān)鍵因子，被稱(chēng)為“殺手蛋白”，在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[11-12]。研究證實(shí)，鼠腦缺血后繼發(fā)有心肌損傷。國(guó)內(nèi)外研究顯示病人腦出血后心肌酶譜改變于病后72 h之內(nèi)變化最為明顯，1周后恢復(fù)正常。腦組織缺血可以直接累及丘腦及丘腦下部植物神經(jīng)功能紊亂，兒茶酚胺分泌增加等引起內(nèi)臟器官功能改變，影響心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)和心肌復(fù)極化，引起冠脈痙攣與收縮等而造成心臟缺血、心肌營(yíng)養(yǎng)不良?jí)乃?，?dǎo)致心肌損傷。因此，本研究以心肌損傷標(biāo)志物cTnⅠ，氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH-Px、SOD，炎性因子TNF-α、NF-κB以及Caspase-3為檢測(cè)指標(biāo)，旨在探討α-硫辛酸發(fā)揮缺血再灌注保護(hù)效應(yīng)的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于模型組（P<0.05），表明α-硫辛酸對(duì)缺血再灌注后的神經(jīng)具有一定的保護(hù)作用。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠cTnⅠ、MDA及GSH-Px明顯降低，SOD明顯增高（P<0.05），表明α-硫辛酸對(duì)缺血再灌注誘發(fā)的氧化應(yīng)激有明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)組大鼠TNF-α蛋白表達(dá)顯著低于模型組（P<0.05），表明α-硫辛酸可能通過(guò)抑制TNF-α表達(dá)從而抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組大鼠Caspase-3和NF-κB蛋白表達(dá)量顯著低于模型組（P<0.05），表明α-硫辛酸可通過(guò)抑制Caspase-3和NF-κB蛋白表達(dá)抑制遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。

綜上所述，α-硫辛酸可改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損，降低腦缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平，提高腦細(xì)胞抗氧化能力，同時(shí)抑制Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡，從多途徑發(fā)揮腦缺血再灌注保護(hù)作用。

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Protective effect of α-lipoic Acid on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and its possible mechanism

Meng-min WANG,Zhi TAO,Zhi-hong YANG,Hui-fang LYU
(Department of Pharmacy,Huangpi People's Hospital,Wuhan,Hubei 430300,P.R.China)

【Objective】To observe the protective effect of α-lipoic acid in rat cerebral ischemia and reperfusion on its mechanism of preliminary exploration.【Methods】SD rats were randomly divided into sham operation group, model group and experimental groups of 20,prepared by suture ischemia-reperfusion model,the experimental group was injected intraperitoneally 30min before perfusion α-lipoic acid 20 mg/kg sham group and model group were injected with saline.Observe and compare the two groups of rats neurological function,cardiac injury markers and oxidative stress-related indicators,NF-κB,TNF-α and Caspase-3 expression levels.【Results】The experimental group of neurological scores were significantly lower than the model group(P<0.05),with a statistically significant difference.CTnⅠrats in the experimental group,MDA,GSH-Px were significantly lower than the model group, SOD were significantly higher than the model group(P<0.05),with a statistically significant difference.Experimental group NF-κB,TNF-α and Caspase-3 protein expression was significantly lower than the model group(P<0.05), with a statistically significant difference.【Conclusion】α-lipoic acid may improve cerebral ischemia and reperfusion in rats neurological deficits,reduce cerebral ischemia-reperfusion-induced oxidative stress,and improve the antioxidant capacity of brain cells,while inhibiting Caspase-3-mediated apoptosis from multi-channel play cerebral ischemia and reperfusion.

ischemia-reperfusion;α-lipoic acid;cTnⅠ;MDA;GSH-Px;SOD;NF-κB;TNF-α;Caspase-3

1005-8982（2015）34-0019-04

R743.31

A

2015-06-17

陶智，Tel：18040592217，E-mail：437025192@qq.com